王亮

豬場(chǎng)大腸桿菌滅活苗的制備

王亮

（山東省安丘市畜牧局 262100）

2013年8月，山東省安丘市某豬場(chǎng)突然暴發(fā)仔豬黃白痢病，主要表現(xiàn)為一窩仔豬出生時(shí)體況正常，于12h之后，有一二頭表現(xiàn)全身衰竭，很快死亡。以后其他仔豬相繼發(fā)生腹瀉，糞便呈黃色漿狀，含有凝乳小片。捕捉時(shí)，在掙扎和嗚叫中常由肛門(mén)冒出黃色稀糞，以后迅速脫水，衰竭而死。有的轉(zhuǎn)為拉灰白色粘稠糞便為特征，致使仔豬發(fā)育停滯、消瘦、衰弱、抵抗力下降?；葚S豬場(chǎng)也曾用疫苗預(yù)防和藥物治療仔豬黃白痢，但效果不佳，給豬場(chǎng)帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。為此，從該豬場(chǎng)分離篩選出致病性大腸桿菌株制成鋁膠苗用于該豬場(chǎng)后，仔豬黃白痢得到有效的控制。

1 材料與方法

1.1 材料

用滅菌棉簽從該場(chǎng)典型黃白痢病仔豬肛門(mén)拭取20個(gè)糞樣，置無(wú)菌試管中作為病料。麥康凱和伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(上海市醫(yī)學(xué)化驗(yàn)所試劑廠)，產(chǎn)品型號(hào)20081224；20種大腸桿菌0抗原單價(jià)血清(中監(jiān)所)；腸桿菌科生化編碼鑒定管；鋁膠佐劑(浙江省軍區(qū)后勤部衛(wèi)生防疫檢疫所)，產(chǎn)品型號(hào)20090104。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

15~18日齡小鼠20只，健康家兔10只(杭州市蕭山區(qū)獸醫(yī)衛(wèi)生防疫站)，免疫與非免疫2日齡仔豬各15只，妊娠母豬90頭(惠豐豬場(chǎng)，均為3胎內(nèi)的年輕母豬)。

1.3 純菌株的制備

取病料分別于麥康凱和伊紅美藍(lán)瓊脂平板劃線，經(jīng)37℃培養(yǎng)18~24h后，從麥康凱瓊脂平板上鉤取單個(gè)粉紅色、圓形、稍隆起、邊緣整齊、表面光滑的中等大小菌落或從伊紅美藍(lán)瓊脂上挑取紫黑色、帶金屬光澤閃亮的疑似菌落，涂片，革蘭氏染色，油鏡鏡檢。將檢出兩端鈍圓的G﹣短小桿菌再接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)18~24h，重復(fù)2~3次，確認(rèn)無(wú)雜菌后后分別移至瓊脂斜面上，作為純菌種。

1.4 菌種鑒定

1.4.1 生化試驗(yàn) 參考獸醫(yī)微生物學(xué)及免疫實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)的方法，將個(gè)菌株分別接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖等糖的發(fā)酵生化管中做糖發(fā)酵試驗(yàn)；同時(shí)菌株分別做三糖鐵試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、M．R．試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)，設(shè)對(duì)照組并記錄結(jié)果。

1.4.2 致病性試驗(yàn) 將生化鑒定后的菌株分別接種于普通肉湯，37℃培養(yǎng)18h后備用。取15~18g健康小鼠10只，分成2組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組個(gè)5只小鼠，試驗(yàn)組每只小鼠腹腔注射0.2ml疑似分離菌株肉湯培養(yǎng)液，對(duì)照組不注射，2組隔離飼養(yǎng)觀察，每6h觀察小鼠情況，選擇致病小鼠的大腸桿菌菌株為該場(chǎng)致病菌株。

1.4.3 血清型鑒定 待檢菌株的處理：將純化的待檢菌液涂布于普通瓊脂平板上，于37℃恒溫箱中培養(yǎng)18h后，用適量5g∕L石炭酸生理鹽水洗下菌苔，制成濃稠菌懸液；121℃高壓滅菌2h，破壞K抗原后即為待檢菌的O抗原，4℃保存?zhèn)溆?。血清學(xué)鑒定：按照鑒定血清說(shuō)明書(shū)分別做玻板凝集和試管凝集實(shí)驗(yàn)，鑒定惠豐豬場(chǎng)豬大腸桿菌致病菌株血清型。

1.5 大腸桿菌滅活苗的制備

1.5.1 擴(kuò)菌培養(yǎng) 用接種環(huán)分別鉤取適量不同血清型的菌株，劃線于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板表面，在37℃條件下培養(yǎng)24h后，以滅菌生理鹽水洗下制成懸濁液；再取懸濁液均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板表面，在37℃條件下培養(yǎng)24h，以滅菌生理鹽水洗下菌落。分別置于滅菌瓶中，用麥?zhǔn)媳葷峁芊y(cè)定其含菌數(shù)，使各血清型的菌液含菌數(shù)相等。

1.5.2 滅活 將不同血清型的菌株培養(yǎng)液混合，以滅菌生理鹽水稀釋至含細(xì)菌總數(shù)為200億∕ml。加入甲醛溶液使其在菌液中的最終濃度為0.5%，37℃滅活24~48h，其間振蕩數(shù)次。再加入等菌液體積20%滅菌氫氧化鋁膠，最后加入柳硫汞使最終濃度為0.01%，混勻、檢驗(yàn)、分裝。

1.6 豬場(chǎng)大腸桿菌滅活苗的檢驗(yàn)

1.6.1 性狀和無(wú)菌檢驗(yàn) 肉眼直接觀察滅活苗性狀；混勻并取適量滅活苗，均勻涂布于麥康凱瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)72h后觀察及顯微鏡檢查。

1.6.2 安全性檢查 取10只小白鼠，分別皮下注射菌苗0.5ml∕只，連續(xù)觀察7d；取10只家兔，皮下注射滅活苗2ml∕只，觀察7d，期間每4h測(cè)1次體溫；妊娠母豬10頭，產(chǎn)前15d，肌肉注射4ml∕頭，連續(xù)觀察20d。

1.6.3 攻毒試驗(yàn) 隨機(jī)選取免疫母豬和非免疫母豬所產(chǎn)2日齡仔豬各l5頭，分別用制苗細(xì)菌懸液，按100億∕頭進(jìn)行攻毒，觀察仔豬哺乳期內(nèi)的生長(zhǎng)情況，記錄仔豬發(fā)生黃白痢的頭數(shù)和死亡情況，測(cè)定其對(duì)仔豬的保護(hù)率。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 糖發(fā)酵與生化試驗(yàn)結(jié)果

各菌均可發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖甘露醇，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；少數(shù)菌株發(fā)酵蔗糖，只產(chǎn)酸或產(chǎn)酸并產(chǎn)氣；M．R．試驗(yàn)陽(yáng)性；V—P試驗(yàn)陰性；產(chǎn)生靛基質(zhì)；尿素酶試驗(yàn)陰性；硝酸鹽還原試驗(yàn)陽(yáng)性；吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性；枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)陰性；三糖鐵斜面、底層產(chǎn)酸變黃，有氣體，無(wú)變黑現(xiàn)象。從惠豐豬場(chǎng)共分離到致病性大腸桿菌17株，用玻片凝集法進(jìn)行血清型鑒定，結(jié)果為：O64(7株)，O9(4株)．0149(5株)．一株未知。

2.2 無(wú)菌檢驗(yàn)

滅活苗靜置后分層，上層為澄清液體，下層為乳白色沉淀物，振搖混勻呈均一渾濁液；麥康凱培養(yǎng)基上無(wú)菌生長(zhǎng)。

2.3 安全性檢查

試驗(yàn)用的10只小白鼠、10只家兔觀察7d均無(wú)異常；產(chǎn)前15d妊娠母豬注射后部分母豬有一過(guò)性的厭食反應(yīng)，注射部位輕微紅腫，無(wú)其他不良反應(yīng)，胎兒、新生仔豬在哺乳期內(nèi)均正常。

2.4 攻毒試驗(yàn)

結(jié)果見(jiàn)附表。

附表 2日齡仔豬發(fā)病情況 （頭、%）

組別仔豬數(shù)發(fā)病數(shù)發(fā)病率死亡數(shù)死亡率致死率 免疫組15320.00213.3566.67 非免疫組151386.67746.4661.62

由附表可以看出攻毒后免疫組新生仔豬在哺乳期內(nèi)發(fā)病3頭，其中2頭死亡，死亡率和致死率分別為13.35%、66.67%。攻毒后對(duì)照組新生仔豬在哺乳期內(nèi)發(fā)病13頭，其中7頭死亡，死亡率和致死率分別為46.46%、61.62%，差異顯著(P<0.05)，說(shuō)明滅活苗對(duì)哺乳期內(nèi)的新生仔豬具有較好的保護(hù)作用。

（2014–02–24）

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