陳 肖，余 翔，王永麗，唐 靜，章建浩

（國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點實驗室，農(nóng)業(yè)部農(nóng)畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點開放實驗室，南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

腌制劑不同影響中式發(fā)酵香腸揮發(fā)性成分的組成

陳 肖，余 翔，王永麗，唐 靜，章建浩*

（國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點實驗室，農(nóng)業(yè)部農(nóng)畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點開放實驗室，南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

利用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用提取并分析發(fā)酵香腸中的揮發(fā)性物質(zhì)，并探討3 種不同的腌制劑（硝酸鈉、亞硝酸鈉、亞硝酸鈉和抗壞血酸鈉）對香腸風味物質(zhì)，尤其是來源于支鏈氨基酸的風味成分的影響。結(jié)果表明腌制劑確實會對香腸中的風味物質(zhì)含量產(chǎn)生一定的影響，且硝酸鈉作為腌制劑更有利于乙酸乙酯、丁酸、2-丁酮、2-戊酮、2-庚酮、正己醇、正戊醇等風味物質(zhì)的形成。

固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜；揮發(fā)性物質(zhì)；發(fā)酵香腸

腌制，通常理解為將食鹽、亞硝酸鹽或硝酸鹽加入香腸肉餡中以促進香腸質(zhì)地、風味、色澤等變化的過程[1]，在發(fā)酵香腸的制作過程中常見。同時，腌制也作為一種較好的保藏技術(shù)自古以來廣泛應用，以延長發(fā)酵香腸的貨架期。在北歐地區(qū)，亞硝酸鹽更受歡迎，而在歐洲南部，硝酸鹽則獨樹一幟。亞硝酸鹽（硝酸鹽）在腌制肉制品中的作用已經(jīng)歷多年研究，可以總結(jié)為以下幾點：促進典型性紅色的形成；抑制腐敗菌和致病菌的生長；有助于特征性腌制風味形成；延遲氧化腐敗[2]。通常情況下也會加入抗壞血酸鹽以促進亞硝酸鹽（硝酸鹽）的發(fā)色作用[3]。根據(jù)GB 2760—2007《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》規(guī)定，肉品腌漬時可以添加硝酸鹽或亞硝酸鹽作為發(fā)色劑，但硝酸鹽的最大使用量為0.50 g/kg，亞硝酸鹽的最大使用量為0.15 g/kg。

發(fā)酵香腸的典型性風味不是由單一成分體現(xiàn)出來的，而是多種物質(zhì)綜合作用的結(jié)果。在發(fā)酵香腸中檢測到的幾百種揮發(fā)性物質(zhì)中，不是所有這些物質(zhì)都在風味的形成過程中發(fā)揮作用。有很多物質(zhì)因為具有較高的閾值而不能在香腸中體現(xiàn)出它的氣味。影響發(fā)酵香腸風味物質(zhì)產(chǎn)生的因素有很多，Wirth[4]早在1991年就曾提出硝酸鹽相較于亞硝酸鹽對于發(fā)酵肉制品風味物質(zhì)的產(chǎn)生發(fā)揮重要作用，但尚缺乏科學依據(jù)；Olesen等[5]通過研究抗壞血酸鈉、硝酸鹽、亞硝酸鹽及發(fā)酵劑對于干發(fā)酵香腸揮發(fā)性風味成分含量的影響，發(fā)現(xiàn)抗壞血酸鈉與亞硝酸鹽相結(jié)合時會顯著降低3-甲基丁酸的含量；José等[6]綜合研究硝酸鈉和亞硝酸鈉對于干發(fā)酵香腸理化指標及感官的影響，研究表明硝酸鹽和亞硝酸鹽對于香腸的感官影響作用有限但對于來源于微生物生長和代謝的風味物質(zhì)的產(chǎn)生影響顯著。除了上述腌制劑外，氯化鈉的含量、脂肪含量、風干條件、成熟時間及發(fā)酵劑種類等都會影響風味物質(zhì)的含量。Misharina[7]與Sunesen[8]等研究表明延長香腸的成熟時間會使絕大部分風味物質(zhì)的濃度增加。木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌有利于促進甲基酮類、乙基酯類以及亮氨酸降解產(chǎn)物的生成，從而增強干salami的風味[5]。支鏈氨基酸（branched chain amino acids，BCAAs）如亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸可由這2種菌降解為甲基醛類、醇類和酸類物質(zhì)[9-10]。而在國內(nèi)，對于發(fā)酵香腸風味影響因素的探討主要集中在發(fā)酵劑對其產(chǎn)生的影響，鮮見關于腌制劑的研究。本實驗將著手于3 種不同腌制劑（硝酸鈉、亞硝酸鈉、亞硝酸鈉和抗壞血酸鈉）對于中式香腸風味物質(zhì)尤其是來源于BCAAs的揮發(fā)性成分的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉、豬背膘 南京市天盾農(nóng)貿(mào)市場蘇食冷鮮肉專賣店；食鹽、葡萄糖、太太樂大蒜粉、味精、味美白胡椒粉 南京市蘇果超市；三聚磷酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鈉、L-抗壞血酸鈉 南京壽德試驗器材有限公司；乳酸菌發(fā)酵劑（含植物乳桿菌4045、肉糖葡萄球菌、木糖葡萄球菌 上海潤盈生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

RYJ-120型絞肉機 南京瑞恒食品機械廠；ZB-125型斬拌、TY-160型灌腸機 南京舜天食品機械廠；JA2203N電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司；PHS-3CWpH計型 上海里達精密儀器儀表有限公司；101-O-S電熱恒溫鼓風干燥箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；SPX-250C型恒溫恒濕箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；SW-CJ-IFD型單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；DSQⅡ單四極桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、TRIPLUS-AS型固相微萃取進樣器 美國Thermo公司；75 μm Carboxen-PDMS萃取頭 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵香腸的制備

1.3.1.1 基本配方

表1 3 組香腸肉餡組成Table1 Ingredients of and starter cultures for fermented sausages

1.3.1.2 香腸制作

將買來的新鮮豬肉瘦肉與肥膘丁分離，肥膘丁置于－30 ℃條件下備用[11]。將瘦肉絞碎并于絞制的過程中加入各種輔料，腌制48 h，接入菌種，混勻后填充至48 mm膠原蛋白腸衣中。將灌好的香腸懸掛于恒溫恒濕箱中風干成熟。發(fā)酵過程：24 ℃，92%～96%相對濕度（relative humidity，RH）48 h；20 ℃，83%～88% RH，72 h；18℃，79%～83% RH，96 h。成熟過程：15 ℃，74%～77% RH，14 d。香腸發(fā)酵成熟后真空包裝并貯藏于－20 ℃冰箱中備用。

1.3.2 香腸理化及微生物分析

水分含量測定參照GB/T 9695.15—2008《肉與肉制品水分含量測定》；水分活度（water activity，aw）測定利用水分活度儀在25 ℃條件下進行；pH值測定利用插入式pH計，肉餡與水的質(zhì)量比為1∶1。

對于發(fā)酵香腸來說，乳酸菌的正常生長是保證香腸品質(zhì)的重要前提，而葡萄球菌則是重要的“呈香菌”，因此監(jiān)測這2 種菌種的生長狀況對于香腸形成良好風味非常重要。微生物分析采用平板菌落計數(shù)法：以無菌操作準確稱取肉樣20.0 g于均質(zhì)袋中，加入180 mL生理鹽水，用拍擊式均質(zhì)器拍打2～3 min制成1∶10樣品勻液，然后10 倍梯度稀釋，取3 個合適的梯度培養(yǎng)。乳酸菌選用MRS瓊脂培養(yǎng)基，葡萄球菌選用MSA瓊脂培養(yǎng)基，30 ℃條件下培養(yǎng)3 d。

1.3.3 香腸揮發(fā)性物質(zhì)的萃取與分析

采用固相微萃?。╯olid phase micro-extraction，SPME）法提取揮發(fā)性物質(zhì)[6,12-13]。將冷凍的香腸絞碎，準確稱取3.00 g于20 mL萃取瓶中，并用聚硅酮隔膜密封，復合式萃取頭穿過隔膜插入到萃取瓶，暴露于萃取瓶頂部空間，在60 ℃水浴中振蕩加熱40 min。在收集揮發(fā)性物質(zhì)前，萃取頭預先放置在氣相進口處，于220 ℃條件下加熱50 min。

利用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀分析揮發(fā)性風味物質(zhì)。被萃取頭吸附的物質(zhì)從GC的進樣口于220 ℃條件下解吸6 min。用于分離揮發(fā)性物質(zhì)的毛細管柱為DB-624（50 m×0.32 mm，1.05 μm）；氦氣作為載氣，流速設定為0.3 mL/min；進樣口溫度為220 ℃采用不分流進樣模式；GC采用3 段式程序升溫：初始溫度為38 ℃并保持13 min；持續(xù)增加至110 ℃，增溫速率為3 ℃/min；之后上升至150 ℃，4 ℃/min；最后溫度達到210 ℃，10 ℃/min，并保持5 min[14]。電子電離源；電子能量為70 eV；質(zhì)量掃描范圍m/z 40～300。

利用計算機比較樣品和Mainlib、Nlstdemo、Replib、Willey 4 個標準譜庫的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行成分鑒定，以相似指數(shù)和反相似指數(shù)均大于800作為定性依據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個處理組3 個重復。所有實驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel進行統(tǒng)計出來，SAS 9.2統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，平均值之間利用Fisher’s最小顯著差異法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化及微生物分析結(jié)果

香腸風干成熟過程中的pH值與aw值是檢測香腸品質(zhì)穩(wěn)定與安全的2 個基本指標[15]。pH值變化如圖1所示，aw值變化如圖2所示。

圖1 香腸各處理風干成熟過程中pH值的變化Fig.1 Change in pH of fermented sausages with added different curing agents during ripening

從圖1可以看出，由于乳酸菌的生長，香腸的pH值迅速下降到4.5左右，在之后的成熟過程中，pH值又出現(xiàn)緩慢地小幅度增加，這主要是由于在后期乳酸菌生長受限及胺類物質(zhì)產(chǎn)生[16]。在3 個處理組中，亞硝酸鈉組pH值稍高于硝酸鈉組，這可能與亞硝酸鈉的抑菌性有關，但差異并不顯著[17]。

圖2 香腸各處理風干成熟過程中aw值的變化Fig.2 Change in awof fermented sausages with added different curing agents during ripening

發(fā)酵香腸中抑制腐敗的柵欄因子有亞硝酸鹽、氧化還原電位、競爭性菌落、aw值和pH值等，而aw值是唯一一個作用逐漸增加的防腐柵欄因子，大部分的腐敗菌在aw值低于0.9時就會停止生長[18]，而本實驗的3 個處理組別的aw值雖然沒有達到0.9以下，但已經(jīng)是較低的水平（低于0.92），這對發(fā)酵香腸的貯藏性起到很大作用。3 個處理組別aw值均呈現(xiàn)不斷下降趨勢，且程度類似，沒有表現(xiàn)出顯著的差異性（P＞0.05）。在風干成熟的第2天，aw值存在差異，并且硝酸鈉與亞硝酸鈉作為腌制劑的香腸aw值高于加入了抗壞血酸鈉的香腸aw值，目前原因尚不清楚。

在微生物方面，乳酸菌與葡萄球菌從第2天開始都經(jīng)歷快速增殖，并在后期呈現(xiàn)出小幅度下降趨勢。其中乳酸菌增長到8（lg（CFU/g））左右，且亞硝酸鈉組（亞硝酸鈉組與亞硝酸鈉＋抗壞血酸鈉組）乳酸菌菌落數(shù)稍低于硝酸鈉組，這也與pH值的變化相一致。葡萄球菌增長到6（lg（CFU/g）），并未表現(xiàn)出明顯差異。充分證明發(fā)酵香腸中乳酸菌的優(yōu)勢地位，也解釋了pH值出現(xiàn)的迅速下降的事實。

2.2 揮發(fā)性物質(zhì)分析

在檢測出的揮發(fā)性風味物質(zhì)中，為更好地研究來源于香腸各生化反應的風味成分，根據(jù)Berger等[19]研究，剔除掉來源于香辛料的風味物質(zhì)如肉豆蔻醚、香葉丙酮、吡嗪類、萜烯類及來源于大蒜粉的大多數(shù)含硫化合物之后，共鑒定出35 種成分。并根據(jù)這些物質(zhì)可能的來源分為5 組：碳水化合物分解代謝（7）、氨基酸代謝（13）、脂肪酸降解（9）、次級代謝酯類物質(zhì)（3）、其他來源（3）、不同腌制劑對于香腸中揮發(fā)性物質(zhì)的影響見表2。

腌制劑對于香腸揮發(fā)性風味物質(zhì)的形成具有顯著影響（表2）。幾乎在所有的來源于BCAAs（亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸）代謝的揮發(fā)性物質(zhì)中，硝酸鈉腌制組中的濃度均高于亞硝酸鈉腌制組，除了2-甲基丙醇、苯乙醛和乙酰苯外，且這3 種物質(zhì)在亞硝酸鈉腌制組的優(yōu)勢作用并不顯著（P＞0.05）。這種現(xiàn)象可以解釋為由于亞硝酸鈉對于BCAAs降解具有負面影響，從而顯現(xiàn)出硝酸鈉的促進作用。當然，這也與葡萄球菌有很大關系。在氧氣存在時，部分葡萄球菌（其中包括肉糖葡萄球菌）會利用硝酸鈉或亞硝酸鈉作為電子受體進行代謝作用，促進風味物質(zhì)的形成。而早在1996年，有學者就發(fā)現(xiàn)肉糖葡萄球菌更傾向于硝酸鈉作為它的受體而不是亞硝酸鈉。2-甲基丙酸、3-甲基丁酸和2-甲基丁酸分別來源于纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的微生物代謝作用，對于香腸風味物質(zhì)的形成期重要作用。原因有三：一是這幾種物質(zhì)對于香腸典型性“sweet”香味的形成具有重要作用；二是它們具有較低的閾值；三是上述3 種物質(zhì)還可以轉(zhuǎn)化為水果味的酯類物質(zhì)，對于風味有積極影響[17]。另外，幾乎在所有香腸中都會出現(xiàn)的苦杏仁味是有苯甲醛帶來的，因此被認定為是一種賦予豬肉特殊氣味的物質(zhì)。它在硝酸鈉組中的含量也高于亞硝酸鈉組，但差異并不顯著（P＞0.05）。

表2 不同腌制劑處理香腸頂部空間鑒離得到的揮發(fā)性物質(zhì)Table2 Volatile compounds identified in the headspace of fermented sausages with added different curing agents

同時，對于碳水化合物代謝產(chǎn)物來說，硝酸鈉對于支鏈酸類和醇類物質(zhì)也具有促進作用。硝酸鈉腌制組中乙酸乙酯的濃度明顯地高于亞硝酸鈉腌制組。這與乙酸呈現(xiàn)出的趨勢一致，因為乙酸乙酯來源于乙酸。與此同時，作為重要的風味物質(zhì)，雙乙酰在硝酸鈉腌制組的含量低于亞硝酸鈉腌制組（P＞0.05），而雙乙酰的還原形態(tài)3-羥基-2丁酮的含量在亞硝酸鈉腌制組中顯著高于硝酸鈉腌制組（P＜0.05）。而丁酸作為賦予香腸重要的發(fā)酵酸味和奶酪味的物質(zhì)，在硝酸鈉組中的含量稍高于亞硝酸鈉組。

大多數(shù)醛類物質(zhì)來自于脂肪氧化。其中己醛、庚醛在硝酸鈉組中的含量低于亞硝酸鈉組，它們作為重要的脂肪降解產(chǎn)物，同時也是香腸中某些令人不愉快的味道產(chǎn)生的原因。2-丁酮、2-戊酮、2-庚酮、正己醇、正戊醇等在硝酸鈉腌制組中含量高于亞硝酸鈉腌制組，可能的原因是亞硝酸鈉與抗壞血酸鈉的抗氧化性部分抑制了脂肪酸的氧化降解或者是硝酸鈉具有氧化作用。加入抗壞血酸鈉的亞硝酸鈉腌制組中上述5 種物質(zhì)含量降低幅度更大，進一步解釋了上述問題。其中2-庚酮對于香腸風味貢獻不大，因為它們具有很高的閾值。Sunesen等[8]的研究結(jié)果也認為作為抗氧化劑的抗壞血酸鈉低于模型香腸中脂肪氧化具有很強的抑制作用。

在其他的成分中，除了3-甲基乙基丁酸甲酯，3 個處理組別并未表現(xiàn)出顯著差異。3-甲基丁醛、2-甲基丁醛以及雙乙酰是對于發(fā)酵香腸的風味形成貢獻最大的揮發(fā)性成分，因為它們具有很高的親油性，并且在香腸風干成熟伊始就開始形成。另外還有在發(fā)酵成熟后期形成的戊醛、己醛、3-甲基乙基丁酸甲酯、3-甲基丁酸與2-甲基丙酸伊始重要的風味貢獻者[20]。

3 結(jié) 論

腌制條件確實會對香腸風味物質(zhì)的形成產(chǎn)生影響。在促進香腸中重要的來源于BCAAs的風味物質(zhì)產(chǎn)生過程中，硝酸鈉比亞硝酸鈉更具優(yōu)勢，而抗壞血酸鈉的主要作用則是抑制脂肪氧化。但這并不能說明硝酸鈉作為腌制劑就是最佳選擇，還應根據(jù)保質(zhì)期、消費者接受程度、生產(chǎn)成本等綜合因素考慮。

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Effects of Different Curing Agents on Volatile Compounds of Chinese Fermented Sausages

CHEN Xiao, YU Xiang, WANG Yong-li, TANG Jing, ZHANG Jian-hao*
(National Center of Meat Quality and Safety Control, Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Key Laboratory of Food Processing and Quality Control, Ministry of Agriculture, College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The volatile compounds in Chinese fermented sausages cured with three different curing agents (sodium nitrate, sodium nitrite, and their combination) were extracted and analyzed by SPME-GC-MS, and the effects of these curing agents on flavor compounds including those derived from branch-chain amino acids were explored. The results showed that the curing agents affected the content of flavor compounds. Sodium nitrate contributed to the formation of flavor compounds such as ethyl acetate, butanoic acid, 2-butanone, 2-pentanone, 2-heptanone, 1-hexanol, 1-pentanol, etc.

solid phase micro-extraction-gas chromatography-mass spectrometry (SPME-GC-MS); volatile compounds; fermented sausages

TS251.1

A

1002-6630（2014）20-0153-05

10.7506/spkx1002-6630-201420031

2014-02-11

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD28B01）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303082-2）

陳肖（1990—），女，碩士研究生，研究方向為畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制。E-mail：2012108075@njau.edu.cn

*通信作者：章建浩（1961—），男，教授，博士，研究方向為畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制。E-mail：nau_zjh@njau.edu.cn