季彩宏，糜 亮，楊麗珍

(1.揚州職業(yè)大學(xué)，江蘇 揚州 225009;2.江蘇省特種設(shè)備安全監(jiān)督檢驗研究院揚州分院，江蘇 揚州 225002)

甲基托布津(簡稱甲托)系高效、低毒、廣譜的內(nèi)吸性殺菌劑，對小麥赤霉病、水稻紋枯病等農(nóng)作物病蟲害有良好的防治效果［1］。合成的甲托常常會出現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量和收率不穩(wěn)定，這主要是由雜質(zhì)引起的。本文采用柱層析分離和薄層層析監(jiān)控對甲托進(jìn)行雜質(zhì)分離，用液譜色譜分析相結(jié)合的方法對雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行確定。

1 儀器及試劑

1.1 儀器

WR S-1 B 數(shù)字熔點儀;層析柱(2. 5cm ×50cm);氮吹儀;三用紫外分析儀;島津液相色譜儀(LC-20AT 型，含紫外檢測器和自動進(jìn)樣器);Bruker-400 MHz 核磁共振儀，美國熱電公司LCQ Deca XP Max 液質(zhì)聯(lián)用儀配有Finnigan Surveyor PDA 紫外可見二極管陣列檢測器、ESI/APCI 離子源和離子阱質(zhì)量分析器。

1.2 試劑

毛細(xì)管;硅膠G(80 -100 目)(青島海洋化工廠);薄層板(青島海洋化工廠);柱層析用乙酸乙酯，石油醚分析純(國藥集團(tuán));甲基托布津合成粗品(自制)。

2 實驗方法

2.1 甲托合成方法

鄰苯二胺和異硫氰基甲酸甲酯按一定比例混合，選擇適當(dāng)?shù)拇呋瘎┖蜏囟确磻?yīng)，經(jīng)處理后得到甲托粗品。

2.2 展開劑選擇

甲托粗點用乙酸乙酯溶解后，在活化好的薄層上進(jìn)行點樣，然后放進(jìn)展開劑中展開。在紫外分光儀下觀察樣板，記錄各點的位置，計算Rf 值，確定最佳展開劑。

2.3 柱層析分離

將105℃烘干的硅膠邊攪拌邊加入石油醚中，裝到層析柱2/3 處，將填入的硅膠壓實。

把甲托粗品用乙酸乙酯溶解，用膠頭滴管吸取均勻填料，從層析柱頂口慢慢均勻的加在石英砂上。待石油醚液面高于硅膠面3.0cm 左右時，加入洗脫液，控制洗脫流速為0.7 - 1.2mL·min-1。每10mL 收集1 個洗脫份，氮氣吹干溶劑后，用定量甲醇溶解后進(jìn)行液相色譜分析。

2.4 檢測條件

C18 色譜柱:4.6mm ×250mm，5μm，流動相為甲醇∶純水=50∶50(v/v)，蒸餾水在使用前用超聲脫氣，載液流速為1mL·min-1，柱溫為30℃;進(jìn)樣量為5mL，紫外檢測波長為269nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 展開劑的極性選擇

影響薄層層析分離效果的主要因素有被分離物質(zhì)的極性、吸附劑的極性和展開劑的極性。分離對象甲托和雜質(zhì)的極性與硅膠的吸附性能都是一定的，因此主要通過調(diào)變展開劑的性質(zhì)來提高組分的分離效果［2］。根據(jù)溶劑極性表中常用溶劑的極性大小，要求展開劑對所分離物質(zhì)具有良好的溶解性，與待測組分的Rf 值 在0.2 ～0.8 之間，且不與待測組分或吸附劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，沸點適中，黏度較小。復(fù)配了乙酸乙酯和石油醚進(jìn)行實驗比較:乙酸乙酯∶石油醚分別為7∶10、3∶2、1∶1、2∶1，分離結(jié)果見圖1。

圖1 不同比例展開劑中薄層色譜分析

因為乙酸乙酯的極性比石油醚大，當(dāng)石油醚比例較高時，展開劑極性較弱，兩物質(zhì)洗脫速度較慢，而且不易分開，當(dāng)乙酸乙酯比例較高時，兩物質(zhì)洗脫速度太快，分離度也不好，于是在這兩個極端極性中進(jìn)行調(diào)配，當(dāng)乙酸乙酯∶石油醚=3∶2時，效果最佳。

3.2 柱層析分離

柱層析分離物質(zhì)利用混合物中各種物質(zhì)的極性不同，從而在層析柱中以不同的流速流下，在柱內(nèi)形成一些移動的譜帶，每一條譜帶中含有一個單一的化合物，這樣就可以收集所要的純凈的物質(zhì)［3-5］。由于甲托樣品幾乎是白色，所以，通過液相色譜來檢測，檢測前必須用氮吹儀吹干溶劑后用適量甲醇溶解后再進(jìn)樣。圖2 為分離前甲托原樣的液譜圖，甲托原樣在9.3min(保留時間)出峰，含量為91.63%，7.4min(保留時間)出峰，主要雜質(zhì)含量6.40%，其他雜質(zhì)和基線影響含量為1.97%。圖3 為柱層分離過程中收集到的物質(zhì)的液相譜圖，(a)為甲托峰，保留時間為9. 7min，(b)為甲托和雜質(zhì)過液態(tài)峰，(c)為雜質(zhì)峰，保留時間為7.4min。

雜質(zhì)高溫易分解，因此氮吹溫度為室溫，雜質(zhì)需經(jīng)多次分離富集。

3.3 雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的認(rèn)定

由于觀察分離后的化合物的顏色，晶形，熔點都與甲托純品比較相似，所以，必須借助其他手段進(jìn)行分析。

圖2 甲托分離前原樣液譜圖

圖3 柱層析收集的物質(zhì)的液譜分析

3.3.1 雜質(zhì)的1H NMR 譜圖

圖4 雜質(zhì)的1H NMR 譜圖

由圖4 可知，雜質(zhì)主要幾個結(jié)構(gòu)(7.063 ～8.402)是芳環(huán)上共軛的3H 為多重峰，(4.105 -4.140)是N -H 的多重峰，(3.489 -3.861)甲基上的氫，由特殊軟件分析甲托分子結(jié)構(gòu)和猜測的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)上的氫極性數(shù)據(jù)(見圖5)，可以推算出雜質(zhì)與甲托的1H NMR 譜圖相差很細(xì)微。

圖5 結(jié)構(gòu)與氫極性數(shù)據(jù)

3.3.2 雜質(zhì)的HPLC-MS 分析

甲托和雜質(zhì)的HPLC—MS 譜圖見圖6，其中m·z-1為質(zhì)核比。由雜質(zhì)的質(zhì)譜圖可知，349.02 是分子離子峰即［M+Na］+峰，該化合物的相對分子質(zhì)量為326，而由甲托質(zhì)譜圖365.02 是分子離子峰即［M +Na］+峰，即該化合物的相對分子質(zhì)量為342，考慮到雜質(zhì)的分子量比甲基硫菌靈小16，那么可能的結(jié)構(gòu)有兩種情況:一是甲基硫菌靈分子中的一個硫原子被氧原子替代;二是甲基硫菌靈分子中一個氧原子丟失，即一個-OCH3被-CH3替代。結(jié)合生產(chǎn)實際，認(rèn)為在生產(chǎn)過程中甲基硫菌靈分子結(jié)構(gòu)中的碳硫雙鍵被氧化為碳氧雙鍵。從上述分析得出的雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)來看，其雜質(zhì)可能的來源有:(1)反應(yīng)使用的原料不純，導(dǎo)致產(chǎn)生雜質(zhì)產(chǎn)物;(2)反應(yīng)過程中發(fā)生副反應(yīng)(水解或者氧化)，使得甲基硫菌靈分子結(jié)構(gòu)中的碳硫雙鍵變成碳氧雙鍵，那么盡量創(chuàng)造無氧的反應(yīng)條件。

圖6 雜質(zhì)和甲托的質(zhì)譜圖

4 結(jié)論

通過TLC 確定最佳展開劑體系，TLC 實驗最佳的展開劑體系的體積比為:乙酸乙酯∶石油醚=3∶2。柱層析分離雜質(zhì)的適宜條件:0.5mL 的粗品上硅膠(80 -100 目)的層析柱，流動相為乙酸乙酯∶石油醚(3∶2，V/V)，流速為0.9mL·min-1。通過對1H NMR 和HPLC-MS 圖譜及其解析可知，雜質(zhì)的分子量比甲基硫菌靈小16，結(jié)合生產(chǎn)實際，我們認(rèn)為在生產(chǎn)過程中甲級硫菌靈分子結(jié)構(gòu)中的碳硫雙鍵被氧化為碳氧雙鍵了。其雜質(zhì)可能的來源有:(1)反應(yīng)使用的原料不純，導(dǎo)致產(chǎn)生雜質(zhì)產(chǎn)物;(2)反應(yīng)過程中發(fā)生副反應(yīng)(水解或者氧化)，使得甲級硫菌靈分子結(jié)構(gòu)中的碳硫雙鍵變成碳氧雙鍵，應(yīng)注意調(diào)整反應(yīng)的條件。

［1］ 吳春芳，安煥霞. 不同濃度的甲基托布津防治松針褐斑病藥效試驗［J］.山東林業(yè)科技，2011(4):72 -73.

［2］ 何志昂，王權(quán).淺談TLC 中展開劑的選擇［J］.中國高新技術(shù)企業(yè)，2009(7):44 -45.

［3］ 凌偉軍，余倩，黃淋佳，等.柱層析分離提純麝香草酚的研究［J］.食品工業(yè)科技，2010(7):242 -244.

［4］ 夏向東，呂飛杰，臺建祥，等.硅膠和硝酸銀硅膠柱層析分離生育酚與生育三烯酚［J］.中國糧油學(xué)報，2004(19):85 -88.

［5］ 何書海，李騰崖，陳菲.高效液相色譜法對環(huán)境樣品中甲基托布津與甲霜靈殘留的測定［J］. 分析測試學(xué)報，2010(2):85 -88.