■劉旭輝 楊亞晉 蔡 軍 商婷婷 張日俊
(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100193;2.西南農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,云南昆明650224)
豆粕作為畜禽最重要的植物性蛋白源被廣泛地 運(yùn)用到飼料中。但由于豆粕中存在大豆球蛋白、β-大豆伴球蛋白和胰蛋白抑制因子等多種抗?fàn)I養(yǎng)因子,其應(yīng)用受到很大的限制[1-3]。豆粕經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵,抗?fàn)I養(yǎng)因子被降解至相當(dāng)?shù)偷臐舛?,甚至被完全消除。大分子蛋白含量降低,水溶性蛋白、小肽和小分子蛋白含量得以提高,脲酶活性降低[4],磷的有效含量提高[5-6]。同時(shí),因生成了大量的益生菌、乳酸和未知生長(zhǎng)因子等物質(zhì)[7],使其成為了一種優(yōu)質(zhì)的功能性蛋白原料[8]。
微生物發(fā)酵已成為一種消除豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子,提高豆粕營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的常用方法。但因?yàn)樗捎枚蛊稍掀焚|(zhì)的差異,發(fā)酵用菌種和發(fā)酵策略的不同,所得到的產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊。行業(yè)中沒(méi)有通行的標(biāo)準(zhǔn)加以規(guī)范,缺少評(píng)價(jià)體系[3]。又因?yàn)榧夹g(shù)不成熟,發(fā)酵成本相對(duì)較高,使得應(yīng)用最為廣泛的還是豆粕,而不是更為優(yōu)良的發(fā)酵豆粕。發(fā)酵豆粕要被大家廣泛地接受,其重點(diǎn)、突破點(diǎn)便是尋找更加優(yōu)秀的菌種,更加高效地去除抗?fàn)I養(yǎng)因子,更加高效地提高肽含量。本研究從提高肽含量這點(diǎn)出發(fā),旨在通過(guò)自主設(shè)計(jì)的ND雙層平板,結(jié)合豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基,從生境中篩選適用于豆粕發(fā)酵的高產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌。
1.1.1 樣品
豆豉和豆腐乳(購(gòu)自超市)、健康豬禽腸道內(nèi)容物、土壤。
1.1.2 培養(yǎng)基
營(yíng)養(yǎng)瓊脂:蛋白胨1%、NaCl 0.5%、牛肉浸膏0.3%、瓊脂2%,pH值7.2,121℃滅菌20 min。
脫脂牛奶瓊脂:脫脂奶粉5%、瓊脂1%,115℃滅菌20 min。
芽孢種子培養(yǎng)基:葡萄糖1%、蛋白胨0.5%、牛肉膏 0.5%、NaCl 0.5%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.02%、CaCl20.02%,pH值7.0,121℃滅菌20 min,下文中省略為“種子”。
ND雙層平板:上層為營(yíng)養(yǎng)瓊脂,下層為脫脂牛奶。分別配制100 ml的營(yíng)養(yǎng)瓊脂和100 ml的脫脂牛奶瓊脂,滅菌后,室溫冷卻至60℃左右時(shí)倒板。先倒脫脂牛奶10 ml于平板中,待冷卻凝固后再倒入營(yíng)養(yǎng)瓊脂10 ml。
豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基:豆粕(過(guò)60目)2%、葡萄糖1%、Na2HPO4·12H2O 0.4%、KH2PO40.03%、CaCl20.1%,pH值自然,121℃滅菌20 min。
1.2.1 初篩
樣品于8.5%無(wú)菌生理鹽水中均質(zhì)后,80℃水浴10 min。10倍梯度稀釋至一定倍數(shù),取后三個(gè)梯度各100 μl,涂布于ND雙層平板。平板倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,挑選周?chē)忻黠@透明水解圈的菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。對(duì)初步選定的菌株劃線純化,并保種備用。
1.2.2 復(fù)篩
初篩得到的菌株接種于芽孢種子培養(yǎng)基,180 r/min、37℃培養(yǎng)18 h?;罨蟮木N按2%接種量接種于豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基,180 r/min、37℃培養(yǎng)48 h。取發(fā)酵液,4℃、10 000 r/min離心10 min。用Folin-酚法測(cè)定上清液蛋白酶活性,參照《GB/T 23527—2009蛋白酶制劑》附錄B酶活力測(cè)定方法的福林法進(jìn)行。
1.2.3 生長(zhǎng)曲線
根據(jù)裝液量(50 ml/250 ml、30 ml/100 ml)、培養(yǎng)基(豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基、芽孢種子培養(yǎng)基)、接種菌齡(12、24 h)及保存方式(現(xiàn)培養(yǎng)、4℃保存)的不同,繪制生長(zhǎng)曲線。試驗(yàn)分組及處理見(jiàn)表1,每隔2 h取樣,適度稀釋后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD600nm。
表1 試驗(yàn)分組及處理
1.2.4 產(chǎn)酶曲線
按2%接種量將目標(biāo)菌株接種于豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基,37℃、180 r/min培養(yǎng)。每隔2 h取樣,4℃、10 000 r/min離心,上清經(jīng)緩沖液適度稀釋后,測(cè)定蛋白酶活性。由此繪制得產(chǎn)酶曲線,以確定菌株的最高產(chǎn)酶量、最高產(chǎn)酶時(shí)間及產(chǎn)酶隨時(shí)間的變化關(guān)系。
1.2.5 菌種鑒定
1.2.5.1 16S rDNA測(cè)序
提取目標(biāo)菌株基因組作為模版,利用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測(cè)序。引物序列:上游引物5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';下 游 引 物 5'-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3';反應(yīng)體系 50 μl:DNA模板1 μl,2×Taq PCR Mix 25 μl,上游引物2 μl,下游引物2 μl,ddH2O 20 μl;擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,共30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10 min。細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化有限公司,引物合成及PCR產(chǎn)物測(cè)序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast在線比對(duì)后,運(yùn)用ClustalX 2和MEGA 5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
1.2.5.2 GyrA測(cè)序
提取目標(biāo)菌株基因組作為模版,以GyrA特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測(cè)序。引物序列:上游引物5'-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3',下游引物 5'-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3';反應(yīng)體系:50 μl:DNA模板1 μl,上游引物2 μl,下游引物2 μl,2×Taq Master Mix 25 μl,ddH2O 20 μl;擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性3 min,94℃變性1 min,55℃退火30 s,72℃延伸75 s,共30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10 min。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成,測(cè)序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。結(jié)果分析同16S rDNA測(cè)序。
運(yùn)用Excel對(duì)數(shù)據(jù)初步整理后采用SAS 9.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。作圖由Graphpad Prism 5完成。
通過(guò)觀察菌株生長(zhǎng)在上層營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面的菌落形態(tài)、菌落周?chē)乃馔该魅η闆r、革蘭氏染色及鏡檢情況,初步確定7株產(chǎn)蛋白酶比較豐富的G+芽孢桿菌進(jìn)入復(fù)篩。菌落在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)及水解透明圈情況見(jiàn)圖1。
圖1 初篩結(jié)果,左圖為背面拍攝的一塊平板,右圖為正面拍攝的一個(gè)菌落
將初篩得到的7株菌接種于豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基,按1.2.2設(shè)計(jì)進(jìn)行復(fù)篩。各菌株在豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好,培養(yǎng)48 h后測(cè)定發(fā)酵上清液中蛋白酶活性,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。從中篩選得到T1,它來(lái)自豆豉樣品。
表2 復(fù)篩結(jié)果
根據(jù)1.2.3設(shè)計(jì),繪制T1在0~24 h時(shí)間段的生長(zhǎng)曲線,見(jiàn)圖2。從A、B、C、D曲線圖形基本一致可以看出,不同的接種菌齡、裝液量和本試驗(yàn)用到的兩種不同的培養(yǎng)基對(duì)T1的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的影響。生長(zhǎng)曲線的前段存在明顯差異的E組因接種的是4℃保存斜面培養(yǎng)基上的菌落,它需要更多的時(shí)間才進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
圖2 T1的生長(zhǎng)曲線
圖3為接種T1產(chǎn)蛋白酶曲線,從中可以看出0~42 h上清液中蛋白酶活性逐漸升高,在42 h時(shí)達(dá)最高值,為1 683.99 U,而后趨于平緩甚至降低。
圖3 T1產(chǎn)蛋白酶活曲線
16S rDNA鑒定結(jié)果:以T1的基因組為模版PCR擴(kuò)增得到1 465 bp的特異性產(chǎn)物。經(jīng)NCBI Blast比對(duì),T1與Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum strain M20J和Bacillus subtilis strain CICC10265的同源性最高,相似度都達(dá)99%,從而鑒定T1為枯草芽孢桿菌或解淀粉芽孢桿菌。由Clustal X2和MEGA 5.1構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖4,樹(shù)枝上的數(shù)字表示Bootstrap驗(yàn)證中該樹(shù)枝可信度的百分比。
圖4 T1 16S rDNA鑒定結(jié)果
Gyrase A鑒定結(jié)果:以 T1的基因組為模版,通過(guò)Gyrase A部分序列擴(kuò)增得到937 bp的PCR產(chǎn)物。經(jīng)NCBI Blast比對(duì),T1與Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum YAU B9601-Y2和Bacillus amyloliquefaciens Y2同源性最高,這兩株菌都屬于解淀粉芽孢桿菌,由此鑒定得T1為解淀粉芽孢桿菌,結(jié)果見(jiàn)圖5。
圖5 T1 GyrA鑒定結(jié)果
篩選產(chǎn)蛋白酶的微生物,大家普遍采用酪素平板[9-11]或脫脂牛奶平板[12]。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)酪素平板上面的蛋白水解透明圈不明顯,存放幾天后甚至消失。脫脂牛奶平板營(yíng)養(yǎng)不豐富,某些不能利用乳糖的細(xì)菌在其上幾乎不生長(zhǎng);同時(shí)由于培養(yǎng)基表面過(guò)于濕潤(rùn)光滑,某些能利用乳糖作為碳源的細(xì)菌在上面生長(zhǎng)時(shí)菌落擴(kuò)散十分厲害,不利于觀察。并且,以上兩種培養(yǎng)基都不能夠在篩菌的同時(shí)從菌落形態(tài)上對(duì)生長(zhǎng)的菌株進(jìn)行初步的判斷。
熊濤等[13]在篩菌時(shí)用到雙層平板,其下層為瓊脂水,上層為一般性培養(yǎng)基,目的是要在平板內(nèi)創(chuàng)造更加適合厭氧菌生長(zhǎng)的厭氧環(huán)境。本試驗(yàn)從篩選產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌這一目的出發(fā),創(chuàng)新采用ND雙層板。菌落在上層營(yíng)養(yǎng)瓊脂表面正常生長(zhǎng),生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的蛋白酶擴(kuò)散至下層,水解下層的脫脂牛奶,形成透明圈。本方法在檢查蛋白酶活性的同時(shí)可以對(duì)菌株形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察,對(duì)菌株種類(lèi)做出初步的判定。同時(shí)還克服了脫脂牛奶平板對(duì)于細(xì)菌生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)不全和酪素平板透明圈不明顯的缺點(diǎn)。
孫妍等[10]從納豆中篩選得到一株納豆芽孢桿菌NB1,發(fā)酵液中蛋白酶活性為19.41 U/ml。馬桂珍等[12]從土壤中篩選得到一株地衣芽孢桿菌GD-2-2,酶活力為447.6 U/ml。王振華[11]從其實(shí)驗(yàn)室保存菌株中篩選出一株枯草芽孢桿菌,蛋白酶活為446.889 U。熊濤等[13]從豆制品中篩選得到一株枯草芽孢桿菌NCU646,厭氧條件下在豆粕固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵96 h后蛋白酶活達(dá)9 600 U/g。本試驗(yàn)篩選得到的解淀粉芽孢桿菌T1在豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)42 h,上清液蛋白酶活性可達(dá)1 683.99 U。從生長(zhǎng)曲線還能看出T1生長(zhǎng)迅速,8~9 h便能達(dá)到穩(wěn)定期,16 h后芽孢迅速增多,體現(xiàn)在曲線后段的再一次攀升。
枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌同屬于枯草芽孢桿菌組的菌種,由于親緣關(guān)系很近,序列間相似度很高,不能通過(guò)16S rDNA將他們有效地分開(kāi)。有研究者發(fā)現(xiàn),以編碼蛋白的基因作為系統(tǒng)發(fā)育鑒定標(biāo)記可以彌補(bǔ)這一缺陷,如DNA促旋酶A亞基編碼基因GyrA[14]。本試驗(yàn)先通過(guò)16S rDNA測(cè)序,確定T1為枯草芽孢桿菌屬,但不能區(qū)分開(kāi)T1是枯草芽孢桿菌還是解淀粉芽孢桿菌。在此情況下,克隆了部分GyrA基因用于測(cè)序,并最終鑒定T1為解淀粉芽孢桿菌。
①運(yùn)用ND雙層平板和豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基從豆豉中篩選得到一株高產(chǎn)蛋白酶芽孢桿菌T1。它在豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基中,37℃、180 r/min培養(yǎng)42 h,上清液蛋白酶活性可達(dá)1 683.99 U。
②通過(guò)16S rDNA和GyrA部分序列擴(kuò)增測(cè)序,鑒定T1為解淀粉芽孢桿菌。