樊肇勝，程 佳，王利軍，李丹丹，秦 莉，張艷玲，董阿力德爾圖，朝格圖

短瓣金蓮花不同提取部位的抗氧化活性

樊肇勝，程 佳，王利軍，李丹丹，秦 莉，張艷玲*，董阿力德爾圖，朝格圖

（內(nèi)蒙古大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021）

目的：研究短瓣金蓮花的抗氧化活性部位。方法：將短瓣金蓮花藥材依次用石油醚、乙酸乙酯、95%乙醇、60%乙醇、30%乙醇和去離子水提取，采用紫外-可見分光光度法對不同溶劑提取部位的黃色素、總黃酮和總酚含量進行分析，并測試各提取部位對羥自由基（·OH）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除作用以對其抗氧化活性進行研究。結(jié)果：短瓣金蓮花石油醚提取部位的黃色素含量最高，為（11.37±0.07 ）mg/g；而60%乙醇提取部位總黃酮和總酚含量最高，分別為（213.21±1.12）mg/g和（121.75±0.58） mg/g，95%乙醇提取部位次之，分別為（200.47±0.65）mg/g和（105.19±0.61）mg/g。石油醚提取部位清除·OH能力最強，半抑制濃度（50% inhibiting concentration，IC50）為92.77 mg/L；95%乙醇提取部位清除DPPH自由基能力最強，IC50為10.14 mg/L，60%乙醇提取部位次之，IC50為10.70 mg/L。結(jié)論：短瓣金蓮花清除·OH能力與黃色素含量呈正相關(guān)性，而清除DPPH自由基能力與黃酮和多酚含量呈正相關(guān)性；短瓣金蓮花的石油醚和95%乙醇提取部位是最佳的抗氧化活性部位，有待進一步深入研究。

短瓣金蓮花；抗氧化活性部位；黃色素；總黃酮；總酚；羥自由基；DPPH自由基

短瓣金蓮花（Trollius ledebouri Reichb.）為毛茛科金蓮花屬多年生草本植物，在我國主要分布于黑龍江及內(nèi)蒙古東北部等地區(qū)，其花為蒙藥金蓮花（阿拉藤花-其其格）的藥用品種之一，具有清熱解毒、消腫、明目等功效，主治感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、急性鼓膜炎和急性淋巴管炎，在民間亦作保健茶飲用[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)，短瓣金蓮花與金蓮花類似，主要含有黃酮類、黃色素、生物堿、揮發(fā)油、鞣質(zhì)及有機酸等化學(xué)成分，具有抗氧化、抑菌、抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛等活性[5-14]?，F(xiàn)代藥理研究表明黃酮類化合物為金蓮花屬植物主要有效成分，生藥鑒別和藥品質(zhì)量評價也均以黃酮類成分葒草苷、牡荊苷等為指標(biāo)[6]。李楠[15]、趙二勞[16]、侯濱濱[17]等發(fā)現(xiàn)金蓮花中黃酮類化合物對食用油脂具有較強的抗氧化作用，且不會造成健康損害，具有良好的開發(fā)前景。此外，金蓮花中含有大量黃色素，其主要成分為葉黃素-環(huán)氧化合物及金蓮花黃質(zhì)，屬于類胡蘿卜素類成分，具有良好的抗氧化活性，但其研究較少[18-19]。本實驗系統(tǒng)研究了短瓣金蓮花不同溶劑提取部位黃色素、總黃酮和總酚含量及其清除羥自由基（·OH）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的能力，為其臨床藥用和天然抗氧化劑的進一步開發(fā)提供實驗依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金蓮花藥材購自亳州市京皖中藥飲片廠（產(chǎn)地：東北），經(jīng)鑒定為毛莨科植物短瓣金蓮花的干燥花。

石油醚（沸點60～90 ℃）、乙酸乙酯、95%乙醇、硫酸亞鐵、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鈉、雙氧水（均為分析純） 天津市北聯(lián)精細化學(xué)品開發(fā)有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、碳酸鈉（均為分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；DPPH（純度≥96%）、焦性沒食子酸（分析純）、鄰二氮菲 阿拉丁試劑有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純≥98%） 北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；抗壞血酸 天津市光復(fù)精細化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

U-3900H紫外-可見分光光度計 日本日立公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵 鞏義予華儀器公司；DZF-6090真空干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；MILLI-Q DIRECT 8超純水器 美國Millipore公司；VFD-1000冷凍干燥機北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；FA1004分析天平 上海精天電子儀器有限公司；pH計 奧豪斯儀器上海有限公司；DF-101XP集熱式水浴鍋 江蘇正基儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 短瓣金蓮花的提取

將干燥短瓣金蓮花稱取適量，粉碎，依次分別用石油醚（沸點60～90 ℃）、乙酸乙酯、95%乙醇、60%乙醇、30%乙醇和去離子水加熱回流提取，各3 次，將各提取液過濾、減壓濃縮并冷凍干燥后得到各提取部位。

1.3.2 黃色素含量的測定

黃色素的含量以葉黃素計。葉黃素在波長（446±1）nm處有最大吸收，可根據(jù)該波長處測定吸光度和標(biāo)準(zhǔn)百分吸光系數(shù)E1%1cm計算其含量。試樣中黃色素含量X以質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）表示[20]，其計算見公式（1）。

式中：A為短瓣金蓮花各提取部位吸光度；N為稀釋倍數(shù)；m為短瓣金蓮花各提取部位質(zhì)量/g；2 550為葉黃素百分吸光系數(shù)（E1%1cm）。

以適當(dāng)乙醇-水溶液配制短瓣金蓮花石油醚、乙酸乙酯、95%乙醇、60%乙醇、30%乙醇和去離子水提取部位的測試溶液。用紫外-可見分光光度計測定，以無水乙醇為空白對照，在447 nm波長處測定短瓣金蓮花各提取部位的吸光度，將檢測得到的吸光度代入公式（1），得到短瓣金蓮花不同提取部位的黃色素含量。

1.3.3 總黃酮含量的測定

[15-16,21]，以蘆丁作對照品，測定短瓣金蓮花不同提取部位的總黃酮含量。準(zhǔn)確吸取60%的乙醇配制質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于10 mL試管內(nèi)，相應(yīng)加入2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0 mL的60%乙醇溶液；再加入0.5 mL 5%亞硝酸鈉溶液搖勻，放置6 min；加入0.5 mL 10%硝酸鋁溶液，放置6 min；加入4.0 mL 4%氫氧化鈉溶液，最后加60%乙醇溶液定容到10 mL，搖勻后，放置15 min；在505 nm波長處測定吸光度。用0.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液作為空白，以蘆丁質(zhì)量濃度（9.15×10-3、18.30×10-3、27.45×10-3、36.60×10-3、45.75×10-3mg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為：y= 56.225x+0.221 5（R2=0.998 8）。短瓣金蓮花不同提取部位分別配制成溶液后同法測定，將吸光度代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到短瓣金蓮花不同提取物中總黃酮的含量。實驗重復(fù)3 次。

1.3.4 總酚含量的測定

參考文獻[22-23]，以焦性沒食子酸作對照品，采用Folin-Ciocalteu法測定短瓣金蓮花不同提取部位的總酚含量。精確吸取質(zhì)量濃度為0.020 mg/mL的焦性沒食子酸溶液0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mL，分別置于10 mL比色管中，均加入5 mL去離子水、0.5 mL Folin-Ciocalteu試劑，1 min后加入1.5 mL質(zhì)量濃度為75.0 mg/mL的Na2CO3溶液，去離子水定容至刻度，搖勻，75 ℃水浴反應(yīng)10 min。在最大吸收波長767 nm處測定吸光度。用0.00 mL焦性沒食子酸溶液作為空白，以焦性沒食子酸質(zhì)量濃度（5×10-4、10×10-4、15×10-4、20×10-4、25×10-4mg/mL）作為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為：y=37.933x-0.317 5（R2=0.996 9）。短瓣金蓮花不同提取部位分別配制成溶液后同法測定，將吸光度代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到短瓣金蓮花不同提取物中總酚的含量。實驗重復(fù)3 次。

1.3.5 對·OH清除作用的測定

利用鄰二氮菲法，精確移取0.5 mL 0.75 mmol/L的鄰二氮菲溶液、1 mL pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）和0.5 mL雙蒸水，搖勻，再加入0.5 mL 0.75 mmol/L的硫酸亞鐵溶液，搖勻，最后再加入0.5 mL 0.01%過氧化氫溶液，37 ℃恒溫水浴60 min，在509.5 nm波長處測定其吸光度，記作A損；另一比色管中用0.5 mL雙蒸水代替0.5 mL過氧化氫，測定其吸光度，記作A未；再在一比色管中用不同質(zhì)量濃度梯度的VC對照溶液或短瓣金蓮花不同溶劑提取部位樣品溶液代替0.5 mL雙蒸水，在509.5 nm波長處測其吸光度，記作A樣。平行測定3 次，記錄吸光度，按式（2）計算不同質(zhì)量濃度VC對照溶液或短瓣金蓮花不同溶劑提取部位樣品溶液對·OH的清除率（S/%），并計算出半抑制濃度（50% inhibiting concentration，IC50）。

1.3.6 對DPPH自由基清除作用的測定

參考文獻[24-25]的方法，將短瓣金蓮花不同溶劑提取部位用60%乙醇配成1 g/L的溶液，VC用去離子水配成0.1 g/L的溶液，用時稀釋至質(zhì)量濃度1、2、3、4、5 mg/L。DPPH用60%乙醇配成65 μmol/L的溶液，依注解加樣于具塞比色管中，搖勻反應(yīng)30 min后，用紫外-可見分光光度計于520 nm（DPPH最大吸收波長）處測定吸光度（60%乙醇溶液為參比）。取3 次實驗的平均值按式（3）計算其清除率并得出IC50。

式中：S為DPPH自由基清除率/%；A0為1.5 mL 65 μmol/L DPPH溶液加入1.5 mL 60%乙醇溶液的吸光度；Ai為1.5 mL 65 μmol/L DPPH溶液加入1.5 mL樣品溶液的吸光度；Aj為1.5 mL 60%乙醇溶液加入1.5 mL樣品溶液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 短瓣金蓮花不同提取部位的提取率

表1 短瓣金蓮花不同溶劑提取部位的提取率Table 1 Extraction rates from the flowers Trollius ledebouri by different solvents

由表1可知，短瓣金蓮花95%乙醇、石油醚和60%乙醇提取部位的樣品量較多，分別占到總提取率的29.67%、25.03%、20.18%。

2.2 短瓣金蓮花不同提取部位的黃色素含量

圖1 短瓣金蓮花不同提取部位的黃色素含量與對·OH的清除作用Fig.1 Yellow pigment content and hydroxyl radical scavenging effects of different solvent extracts from the flowers of Trollius ledebouri

由圖1可知，短瓣金蓮花石油醚提取部位中黃色素含量最多，為（11.37±0.07）mg/g，其次為乙酸乙酯提取部位和去離子水提取部位，分別為（2.77±0.16）mg/g和（2.10±0.14）mg/g，95%、60%和30%乙醇提取部位中黃色素含量相當(dāng)，分別為（1.17±0.07）、（1.27±0.07）、（1.17±0.07）mg/g。

2.3 短瓣金蓮花不同提取部位的總黃酮含量

圖2 短瓣金蓮花不同提取部位的總黃酮和總酚含量與對DPPH自由基的清除作用Fig.2 Contents of total flavonoids and total phenols, and DPPH radical scavenging effects of different solvent extracts from the flowers of Trollius ledebouri

由圖2可知，短瓣金蓮花60%乙醇溶劑提取部位中的總黃酮含量最高，為（213.21±1.12）mg/g；95%乙醇提取部位次之，為（200.47±0.65）mg/g；石油醚提取部位含量最低，為（17.60±0.39）mg/g。

2.4 短瓣金蓮花不同提取部位的總酚含量

由圖2可知，短瓣金蓮花60%乙醇溶劑提取部位中的總酚含量最高，為（121.75±0.58）mg/g；95%乙醇提取部位次之，為（105.19±0.61）mg/g；石油醚和去離子水提取部位總酚含量最低，分別為（14.79±0.22）mg/g和（15.41±0.05）mg/g。

2.5 短瓣金蓮花不同提取部位對·OH的清除作用

表2 短瓣金蓮花不同提取部位和VC對OH的清除作用Table 2 Hydroxyl radical scavenging effects of different solvent extracts from the flowers of Trollius ledebouri

由表2可知，測得短瓣金蓮花不同提取部位對·OH的清除能力由大到小依次為：VC＞石油醚提取部位＞乙酸乙酯提取部位＞95%乙醇提取部位＞60%乙醇提取部位＞去離子水提取部位＞30%乙醇提取部位，其中，石油醚、乙酸乙酯和95%乙醇提取部位的清除能力較強，IC50分別為92.77、106.54、110.90 mg/L。進一步比較短瓣金蓮花不同提取部位的黃色素含量與對·OH的清除能力（圖1）發(fā)現(xiàn)，黃色素含量與對·OH的清除能力呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性。

2.6 短瓣金蓮花不同提取部位對DPPH自由基的清除作用

表3 短瓣金蓮花不同提取部位和VC對DPPH自由基的清除作用Table 3 DPPH radical scavenging effects of different solvent extracts from the flowers of Trollius ledebouri

由表3可知，短瓣金蓮花不同溶劑提取部位對DPPH自由基的清除能力依次為：VC＞95%乙醇提取部位＞60%乙醇提取部位＞乙酸乙酯提取部位＞30%乙醇提取部位＞去離子水提取物部位＞石油醚提取部位，其中，95%提取部位清除DPPH自由基的能力是最強的，IC50值為10.14 mg/L，60%乙醇提取部位次之，IC50值為10.70 mg/L，與對照VC（IC50=2.44 mg/L）較為接近。進一步比較短瓣金蓮花不同提取部位的總黃酮和總酚含量與對DPPH自由基的清除能力（圖2）發(fā)現(xiàn)，總黃酮和總酚含量與對DPPH自由基的清除能力呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性。

3 結(jié) 論

本實驗發(fā)現(xiàn)，短瓣金蓮花石油醚提取部位提取率較高、黃色素含量最高、總黃酮和總酚含量最低、清除·OH能力最強；95%和60%乙醇提取部位提取率亦較高、黃色素含量最低、總黃酮和總酚含量最高、清除DPPH自由基的能力最強；而乙酸乙酯部位提取率最低、黃色素、總黃酮和總多酚含量均較低、清除·OH和DPPH自由基的能力較弱。短瓣金蓮花清除·OH的能力與黃色素含量呈正相關(guān)性，而清除DPPH自由基的能力與總黃酮和總酚含量呈正相關(guān)性。不同部位清除不同類型自由基的能力不同。

綜合分析短瓣金蓮花對·OH和DPPH自由基的能力，可知其石油醚、乙酸乙酯、95%和60%乙醇提取部位均具有一定的抗氧化活性。而進一步結(jié)合各部位提取率的情況，可知石油醚和95%乙醇提取部位是短瓣金蓮花的最佳抗氧化活性部位。短瓣金蓮花含有黃酮類、黃色素、生物堿、揮發(fā)油、鞣質(zhì)及有機酸等化學(xué)成分，其抗氧化活性是其中所含有多種成分綜合作用的結(jié)果。這兩個活性部位除含黃色素和黃酮類成分外，可能還含有其他具有抗氧化活性的化學(xué)成分，具體還含有哪些抗氧化活性成分、其抗氧化能力以及作用機理有何區(qū)別、各個成分之間有無協(xié)同作用，有待進一步深入研究。

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Antioxidant Activity of Different Solvents Extracts from Flowers of Trollius ledebouri Reichb

FAN Zhao-sheng, CHENG Jia, WANG Li-jun, LI Dan-dan, QIN Li, ZHANG Yan-ling*, DONG Alideertu, Tsogt
(School of Chemistry and Chemical Engineering, Inner Mongolia University, Hohhot 010021, China)

Purpose: To explore the antioxidant activity of different solvent extracts from the flowers of Trollius ledebouri Reichb. Methods: The dried flowers were extracted sequentially with petroleum ether, ethyl acetate, 95% ethanol, 60% ethanol, 30% ethanol and deionized water. Each extract obtained was analyzed by ultraviolet-visible spectrophotometry for the contents of yellow pigment, total flavonoids and total polyphenols, and their radical scavenging activity against hydroxyl and DPPH free radicals were tested. Results: Petroleum ether extract had the highest content of yellow pigment (11.37 ± 0.07) mg/g; 60% ethanol extract from the flowers of Trollius ledebouri had the highest content of total flavonoids (213.21 ± 1.12) mg/g and total polyphenols (121.75 ± 0.58) mg/g, 95% ethanol extract had slightly lower contents of total flavonoids (200.47 ± 6.49) mg/g and total polyphenols (105.19 ± 0.61) mg/g. Petroleum ether extract had the strongest hydroxyl radical scavenging ability with IC50of 92.77 mg/L, while 95% ethanol extract had the strongest DPPH radical scavenging ability with IC50of 10.14 mg/L and 60% ethanol extract had slightly lower DPPH radical scavenging ability with IC50of 10.70 mg/L. Conclusion: The hydroxyl radical scavenging capacity presented a positive correlation with the concentration of yellow pigment, and the DPPH radical scavenging capacity presented a positive correlation with the concentration of total flavonoids and total polyphenols; petroleum ether and 95% ethanol extracts from the flowers of Trollius ledebouri have potent antioxidant activity.

flowers of Trollius ledebouri; antioxidant extracts; yellow pigment; total flavonoids; total polyphenols; hydroxyl radical; DPPH radical

R932；Q949.95

A

1002-6630（2014）17-0012-05

10.7506/spkx1002-6630-201417003

2013-10-19

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目（31160332）；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究項目（NJZZ13015）；內(nèi)蒙古大學(xué)高層次人才引進科研啟動項目（Z20100108）

樊肇勝（1993—），男，本科，主要從事天然產(chǎn)物研究。E-mail：fanzhaoshengfzs@163.com

*通信作者：張艷玲（1979—），女，講師，博士，主要從事天然產(chǎn)物研究。E-mail：zhylthu@126.com