阮功成，曹 慧，徐 斐，于勁松

不同來(lái)源膠原蛋白抗凍活性的研究

阮功成，曹 慧*，徐 斐，于勁松

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 2000 93）

采用酶法制備不同來(lái)源的膠原蛋白，并對(duì)其純度及氨基酸組成進(jìn)行鑒定。在此基礎(chǔ)上，利用差示掃描量熱儀及低溫顯微鏡對(duì)其熱滯活性（thermal hysteresis activity，THA）和重結(jié)晶抑制效應(yīng)（ice recrystallization inhibition，IRI）進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：所制備的膠原蛋白均為典型的Ⅰ型膠原，純度較高，其分子質(zhì)量約為330 kD；相比于牛血清白蛋白，不同來(lái)源的膠原蛋白中，豬皮膠原具有較高的熱滯活性，即當(dāng)保留溫度為-0.2 ℃，體系冰晶含量φ≤5% 時(shí)，THA為0.52 ℃；在豬皮膠原蛋白體系中形成的冰晶為不規(guī)則的圓球形，不易對(duì)細(xì)胞及組織造成傷害，且經(jīng)過(guò)一次循環(huán)后，冰晶無(wú)顯著增大。

抗凍活性；膠原蛋白；熱滯活性；重結(jié)晶抑制效應(yīng)

抗凍蛋白是生物為適應(yīng)極端寒冷環(huán)境而產(chǎn)生的一類多肽或糖肽[1-2]，能以非依數(shù)形式降低溶液的冰點(diǎn)，但對(duì)熔點(diǎn)影響甚微?？箖龅鞍鬃钤缭跇O地魚(yú)類中被發(fā)現(xiàn)[3]。至今為止，人類已經(jīng)在海洋魚(yú)類、陸地昆蟲(chóng)、植物、細(xì)菌和真菌等生物體中分離得到多種抗凍蛋白[4-6]。雖然不同種類的抗凍蛋白結(jié)構(gòu)各不相同，但它們都具有阻止冰晶形成、調(diào)控胞外冰晶的增長(zhǎng)、抑制冰的重晶化，、維持液體的非依凍狀態(tài)等特點(diǎn)。抗凍蛋白特殊的抗凍機(jī)制，使其在食品加工與保藏、冰凍手術(shù)、器官保藏及移植領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。但抗凍蛋白的生產(chǎn)仍存在成本較高、不易產(chǎn)業(yè)化的特點(diǎn)，因而找到合適的抗凍蛋白新資源成為亟待解決的問(wèn)題。

畜禽下腳料中富含膠原蛋白，膠原序列中除了-Gly-Pro（Hyp）-Y-三肽重復(fù)單元外，還有許多-Gly-Z-Y-序列[7-8]。這些重復(fù)單元與Graham等[9]從雪蚤中提取的兩種抗凍蛋白（antifreeze protein，AFP）的重復(fù)序列-Gly-X-X-非常相似[10]。因而，本實(shí)驗(yàn)采用酶法制備了不同來(lái)源的膠原蛋白，并利用差示掃描量熱法及低溫顯微鏡法對(duì)其熱滯活性（thermal hysteresis activity，THA）和重結(jié)晶抑制效應(yīng)（ice recrystallization inhibition，IRI）進(jìn)行了測(cè)定，以期為抗凍蛋白新資源的研究與開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)用雞皮、魚(yú)皮、豬皮購(gòu)自于當(dāng)?shù)夭耸袌?chǎng)，-20 ℃保存。

胃蛋白酶（1∶10 000） 美國(guó)Sigma公司；Ⅰ型膠原標(biāo)準(zhǔn)品、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、溴酚藍(lán)及過(guò)硫酸銨（均為電泳純） 上海博蘊(yùn)生物科技有限公司；其余試劑均為分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

4K15型冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；LGJ-10型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；垂直板電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；PYRIS-1型差示掃描量熱儀（differential scanning calorimeter，DSC） 英國(guó)Perkin Elmer公司；Olympus BH-2相差顯微鏡 上海普赫光電科技有限公司。

1.2 膠原蛋白的提取

根據(jù)文獻(xiàn)[11-16]的方法從不同原料中提取膠原蛋白，具體如下：將原料剪碎（0.2 cm×0.2 cm），以10 倍體積10%丁醇溶液脫脂24 h，每12 h換一次丁醇溶液，再用蒸餾水洗凈；用0.5 mol/L醋酸溶液浸泡脫脂后的豬皮12 h，并以10倍體積的0.5 mol/L醋酸溶液勻漿，在勻漿液中在加入1 g/100 mL胃蛋白酶水解48 h，離心（5 000×g，40 min），收集上清液；在上清液中加入NaCl粉末進(jìn)行鹽析 （使NaCl的終濃度為0.9 mol/L），靜置24 h后離心（5 000×g，60 min）；收集沉淀溶于0.5 mol/L醋酸，并依次用0.02 mol/L的NaH2PO4（pH 8.6）、0.1 mol/L醋酸、蒸餾水作為透析外液進(jìn)行透析，每2 h換一次透析外液；將透析袋內(nèi)的樣品溶液凍干，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

采用SDS-PAGE電泳鑒定膠原蛋白的純度[17]。其中分離膠8 g/100 mL，濃縮膠5 g/100 mL。將制備的膠原蛋白溶液置于沸水浴中煮沸 3 min，10 000 r/min 離心10 min，取上清液15 μL上樣。120 V電壓電泳完畢后，用0.1 g/100 mL考馬斯亮藍(lán)R-250溶液染色6 h，醋酸溶液脫色至背景無(wú)色后用凝膠分析儀拍照。

1.4 氨基酸分析

將制備好的膠原蛋白溶解在6 mol/L鹽酸中，110 ℃水解24 h，蒸干鹽酸，定容得水解液。采用Agilent1100高效液相分析儀分析水解液中氨基酸組成[18]。

1.5 膠原蛋白的熱滯活性

將膠原蛋白樣品配制成20 mg/mL的水溶液。稱取一定質(zhì)量的膠原蛋白密封于鋁皿內(nèi)，并置于DSC儀器內(nèi)。當(dāng)儀器充滿液氮并穩(wěn)定后，首先降溫至-20 ℃保持5 min，再升溫至10 ℃保持5 min，獲得膠原蛋白溶液的熔融熱（ΔHm）和熔點(diǎn)（Tm）。接著，將樣品降溫至-20 ℃保持5 min，然后緩慢升溫至樣品呈部分熔化狀態(tài)，即到達(dá)其保留溫度（Th），保持15 min，再將溫度從Th降至-20 ℃。重復(fù)上述過(guò)程[19-20]，在不同的Th條件下停留15 min，分別記錄不同Th時(shí)樣品的起始結(jié)晶溫度（T0）以及結(jié)晶熱（ΔHr），并分別按照公式（1）和（2）計(jì)算THA和冰晶含量（φ）。以無(wú)抗凍活性的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作為對(duì)照。

1.6 膠原蛋白的重結(jié)晶抑制效應(yīng)

采用Olympus BH-2相差顯微鏡和攝像裝置觀察膠原蛋白溶液中冰晶的生長(zhǎng)習(xí)性和冰晶形態(tài)[21-22]。將不同來(lái)源的膠原蛋白樣品稀釋成質(zhì)量濃度為20 mg/mL的溶液，取10 μL滴到鋁板上，形成半徑約為5 nm，厚度約為50 μm的小冰盤(pán)。然后將其轉(zhuǎn)移到復(fù)合顯微鏡的冷臺(tái)上，以20 ℃/min的速率降溫至-40 ℃，保持5 min，再以1 ℃/min的速率升溫至-14 ℃，拍照，并在-14～-12 ℃之間循環(huán)，且循環(huán)周期為3 min，并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE電泳

圖1 不同來(lái)源膠原蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE of collagens from different sources

由圖1可知，在SDS-PAGE圖譜上出現(xiàn)了α1、α2、β及γ 4 個(gè)條帶。其中，在分子質(zhì)量約110 kD附近出現(xiàn)的2 個(gè)條帶分別為膠原蛋白的α1和α2鏈；在220 kD附近出現(xiàn)的條帶是α鏈的二聚體，即β鏈；在高于220 kD出現(xiàn)的條帶是α鏈的三聚體，即γ鏈。根據(jù)已有的資料表明[23]，這是典型的Ⅰ型膠原蛋白SDS-PAGE圖譜。圖譜上無(wú)其他雜帶，可見(jiàn)所 提膠原蛋白具有較高的純度。

2.2 氨基酸分析

表1 不同來(lái)源膠原蛋白的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of collagens from different sources個(gè)/1 000個(gè)殘基

由表1可知，不同來(lái)源膠原蛋白的氨基酸組成比較相近[11,24]。在常見(jiàn)氨基酸中，甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸含量較高，其中甘氨酸含量幾乎占了總氨基酸的1/3，脯氨酸和丙氨酸含量分別約為10%左右；組氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸含量較低；沒(méi)有檢測(cè)出半胱氨酸，缺乏色氨酸。在非常見(jiàn)氨基酸中，羥脯氨酸含量也較高，但在不同來(lái)源的膠原蛋白中其含量差異較大。

據(jù)研究，膠原中最主要的重復(fù)單元是（-Gly-X-Y）n和（-Gly-Z-X-）n，其中X可能是脯氨酸或羥脯氨酸，Y代表20 種氨基酸中的任何一種[24-25]。這種三肽重復(fù)序列中一些分子質(zhì)量較小的氨基酸殘基（如Pro、Hyp、Ser、Thr等）的羰基氧原子處于同一個(gè)肽平面，且氧原子之間的距離與排列方式與冰晶氧原子相似，因而形成的肽平面可通過(guò)氫鍵結(jié)合于冰晶的表面，從而抑制其生長(zhǎng)[26]。脯氨酸和丙氨酸殘基的烷基側(cè)鏈可提供部分的非極性環(huán)境以穩(wěn)定氫鍵的相互作用。Corcilius等[27]研究發(fā)現(xiàn)，羥脯氨酸聚合物及肽鏈長(zhǎng)度對(duì)冰晶的重結(jié)晶抑制效應(yīng)（ice recrystallization inhibition，IRI）有顯著影響。

2.3 DSC對(duì)不同來(lái)源膠原蛋白熱滯活性的測(cè)定

2.3.1 膠原蛋白樣品的升降溫曲線

以無(wú)抗凍活性的BSA為對(duì)照，測(cè)定了豬皮膠原蛋白的熔融點(diǎn)及結(jié)晶點(diǎn)，結(jié)果如圖2所示。BSA在-1.12 ℃開(kāi)始熔化，在0.94 ℃完全熔化，而膠原蛋白在-1.43 ℃開(kāi)始熔化，0.46 ℃完全熔化，二者熔融峰無(wú)顯著差異，都比較平緩。BSA的起始結(jié)晶溫度為-14.18 ℃，降至-14.36 ℃時(shí)完全結(jié)晶，其結(jié)晶峰很窄僅為0.18 ℃，而膠原蛋白溶液在-15.42 ℃開(kāi)始結(jié)晶，降溫至-17.75 ℃時(shí)凍結(jié)完全，其結(jié)晶峰相對(duì)較寬為2.33 ℃。相比于BSA，膠原蛋白在降低溶液起始結(jié)晶溫度的同時(shí)，也延長(zhǎng)了其完全凍結(jié)所需要的時(shí)間。這可能是由于膠原蛋白通過(guò)氫鍵將其極性側(cè)鏈吸附于冰晶表面，而其非極性側(cè)鏈暴露在外，使冰晶形成了亞顯微曲線表面，導(dǎo)致冰晶表面自由能增加，從而阻止其他水分子進(jìn)一步與冰晶結(jié)合，降低了冰點(diǎn)。

圖2 膠原蛋白（a）與BSA（b）的升降溫曲線Fig.2 DSC curves of collagen (a) and BSA (b) during freezing and melting processes

2.3.2 BSA的熱滯活性

將完全凍結(jié)的BSA升溫至不同保留溫度，使之處于部分熔化狀態(tài)，在不同的保留溫度停留一段時(shí)間，再次降溫使之完全結(jié)晶。不同保留溫度下BSA的熱流曲線如圖3所示，不同保留溫度下BSA的THA如表2所示。

圖3 BSA的DSC熱流曲線圖Fig.3 DSC curve of BSA

表2 不同保留溫度下BSA的熱滯活性Table 2 THA of BSA at various retention temperatures

由表2可知，隨著保留溫度Th的升高，部分熔融BSA平衡體系中融化量逐漸增大，冰晶含量隨之逐漸減少。進(jìn)一步降溫，已融化部分立即重新結(jié)冰，放熱峰同時(shí)出現(xiàn)，且隨著保留溫度Th的升高，再次凍結(jié)峰的面積逐步增大（圖3）。變溫前后的曲線平滑銜接，不存在凍結(jié)滯后的現(xiàn)象，也就是說(shuō)BSA溶液不存在熱滯效應(yīng)。

2.3.3 不同來(lái)源膠原蛋白的熱滯活性

將完全凍結(jié)的不同來(lái)源的膠原蛋白升溫至不同保留溫度，使之處于部分熔化狀態(tài)，在不同的保留溫度停留一段時(shí)間，再次降溫使之完全結(jié)晶。不同保留溫度下各膠原蛋白的熱流曲線如圖4～6所示，不同保留溫度下各膠原蛋白的THA如表3～5所示。

圖4 雞皮膠原蛋白的的DSC熱滯曲線Fig.4 DSC curve of chicken skin collagen solutio n

表3 雞皮膠原蛋白溶液的熱滯活性參數(shù)Table 3 THA parameters of chicken skin collagen

由圖4、表3可見(jiàn)，雞皮膠原的熱滯活性較低，當(dāng)保留溫度為0.09 ℃時(shí)，其熱滯活性最高僅為0.2 ℃。

圖5 魚(yú)皮膠原蛋白的DSC熱滯曲線Fig.5 DSC curve of fish skin collagen solution

表4 魚(yú)皮膠原蛋白溶液的熱滯活性參數(shù)Table 4 THA parameters of fish skin collagen

由圖5、表4可知，在魚(yú)皮膠原體系中，隨著保留溫度的升高，即冰晶含量的逐漸降低，其熱滯活性增加，當(dāng)冰晶含量小于5%時(shí)，凍結(jié)滯后明顯，其THA為0.41 ℃。

圖6 豬皮膠原蛋白溶液的DSC熱滯曲線Fig.6 DSC curve of pig skin collagen solution

表5 豬皮膠原蛋白溶液的熱滯活性參數(shù)Table 5 THA parameters of pig skin collagen

由圖6、表5可知，在豬皮膠原體系中，隨著保留溫度的升高，即冰晶含量的逐漸降低，熱滯活性同樣呈增加的趨勢(shì)。當(dāng)保留溫度為-0.2 ℃，冰晶含量為5%時(shí)，最大的THA被獲得，即為0.52 ℃。

隨著冰晶含量的減少膠原蛋白的THA呈增大趨勢(shì)，這可能是由于處于部分熔融狀態(tài)的膠原蛋白溶液在結(jié)晶過(guò)程中，是以體系中已含有的冰晶為冰核開(kāi)始結(jié)晶，體系中冰晶含量越少，冰晶表面膠原蛋白的吸附覆蓋程度越高，膠原蛋白抑制冰晶繼續(xù)生長(zhǎng)的作用就越強(qiáng)，其溶液完全結(jié)晶所需的時(shí)間就越長(zhǎng)，進(jìn)而測(cè)得的THA也就越高。但是當(dāng)初始冰晶量降到很低甚至接近于零時(shí)，體系中就不存在冰晶核，膠原蛋白不能吸附到冰晶表面而發(fā)揮作用，表現(xiàn)出過(guò)冷現(xiàn)象。由此可見(jiàn)，膠原蛋白的THA并不是某個(gè)恒定的值，而是在一定范圍內(nèi)與初始冰晶量呈負(fù)相關(guān)。膠原蛋白形成的右手螺旋可通過(guò)低分子質(zhì)量氨基酸形成的肽平面向冰核棱面上堆積，并抑制其生長(zhǎng)，因而不同來(lái)源膠原蛋白熱滯活性的差異可能是其空間結(jié)構(gòu)及氨基酸組成的差異導(dǎo)致。

2.4 低溫顯微鏡法測(cè)定不同來(lái)源膠原蛋白的重結(jié)晶抑制效應(yīng)

重結(jié)晶是指已經(jīng)形成的冰晶顆粒之間重新進(jìn)行分配，冰晶尺寸有的增大，有的減小，或者小冰晶聚合成大的冰晶。抗凍蛋白可以吸附到冰晶表面，抑制冰晶的遷移，從而產(chǎn)生重結(jié)晶抑制效應(yīng), 保護(hù)有機(jī)體免受凍結(jié)引起的傷害[2]。重結(jié)晶抑制效應(yīng)可以通過(guò)低溫顯微鏡觀察法進(jìn)行檢測(cè)。

圖7 低溫顯微鏡觀察法測(cè)定不同來(lái)源膠原蛋白的重結(jié)晶抑制效應(yīng)Fig.7 Cryomicroscopic observation of ice recrystallization inhibition in collagen from different sources

BSA體系中形成的冰晶形態(tài)多為扁長(zhǎng)形（圖7Ⅰa），經(jīng)過(guò)一次循環(huán)后，冰晶顯著增大（圖7Ⅰb）。而在各類膠原蛋白形成的體系中，冰晶多為不規(guī)則的圓球形（圖7Ⅱa、7Ⅲa及7Ⅳa）。研究表明，生物避免冰凍傷害必須滿足兩個(gè)條件：1）冰必須在胞外形成；2）冰晶的大小及形狀要受到控制。因此相比于BSA體系中形成的扁長(zhǎng)形冰晶，膠原蛋白對(duì)冰晶的修飾作用在細(xì)胞及組織的保護(hù)中尤為重要[22-23]。經(jīng)過(guò)一次循環(huán)后，豬皮膠原蛋白體系中的冰晶并沒(méi)有顯著生長(zhǎng)（圖7Ⅱb），表明其對(duì)重結(jié)晶有一定的抑制效應(yīng)。

3 結(jié) 論

采用酶法制備了不同來(lái)源的膠原蛋白，并對(duì)其純度、氨基酸組成及抗凍活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，從魚(yú)皮、雞皮及豬皮中提取的膠原為典型的Ⅰ型膠原，且具有較高的純度；不同來(lái)源膠原蛋白的THA存在差異，當(dāng)膠原蛋白質(zhì)量濃度為20 mg/mL 時(shí)，豬皮膠原的THA為0.52 ℃，魚(yú)皮膠原為0.41 ℃，雞皮膠原為0.2 ℃，這可能是由于膠原空間結(jié)構(gòu)及氨基酸組成的不同導(dǎo)致；膠原蛋白的THA并不是某個(gè)恒定的值，而是在一定范圍內(nèi)與初始冰晶量呈負(fù)相關(guān)；相比于BSA體系中形成的扁長(zhǎng)形冰晶，各類膠原蛋白體系中的冰晶形態(tài)多為不規(guī)則的圓球形，經(jīng)過(guò)一次循環(huán)后，豬皮膠原蛋白體系中的冰晶并沒(méi)有顯著生長(zhǎng)，可見(jiàn)其對(duì)重結(jié)晶有一定的抑制效應(yīng)。

[1] 胡小穎, 沈繼紅. 抗凍蛋白的特性,來(lái)源及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 海洋科學(xué), 2008, 32(3): 77-82.

[2] 邵強(qiáng), 李海峰, 劉國(guó)生, 等. 抗凍蛋白的抗凍活性及其測(cè)定方法[J].平原大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 22(4): 111-113.

[3] 田云, 盧向陽(yáng), 張海文. 抗凍蛋白研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)生物工程雜志, 2002, 22(6): 48-53.

[4] CHENG C H. Evolution of the diverse antifreeze proteins[J]. Current Opinion in Genetics & Development, 1998, 8(6): 715-720.

[5] de LUCA C I, COMLEY R, DAVIES P L. Antifreeze proteins bind independently to ice[J]. Biophys, 1998, 74(3): 1502-1508.

[6] GRAETHER S P, SLUPSKY C M, DAVIES P L, et al. Structure of type I antifreeze protein and mutants in supercooled water[J]. Biophysical, 2001, 81(3): 1677-1683.

[7] SMALLWOOD M, WORRALL D, BYASS L, et al. Isolation and characterization of a novel antifreeze protein from carrot (Daucus carota)[J]. Biochemistry, 1999, 340(2): 385-391.

[8] TOMCZAK MELANIE M. A facile method for determining ice recrystallization inhibition by antifreeze proteins[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2003, 311(4): 1041-1046.

[9] GRAHAM L A, DAVIES P L. Glycine-rich antifreeze proteins from snow fleas[J]. Science, 2005, 310: 461.

[10] ZHAO Z, DENG G, LUI Q, et al. Cloning and sequencing of cDNA encoding the LS-12 antifreeze protein in the longhorn sculpin, Myoxocephalus octodecimspinosis[J]. Biochemistry Biophysics Acta, 1998, 1382(2): 177-180.

[11] MATMAROH K, BENJAKUL S, PRODPRAN T, et al. Characteristics of acid soluble collagen and pepsin soluble collagen from scale of spotted golden goatfish (Parupeneus heptacanthus)[J]. Food Chemistry, 2011, 129(2): 1179-1186.

[12] SINGH P, BENJAKUL S, MAQSOODET S, et al. Isolation and characterisation of collagen extracted from the skin of striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus)[J]. Food Chemistry, 2011, 124 (1): 97-105.

[13] HUANG Y R, SHIAU C Y, CHEN H H, et al. Isolation and characterization of acid and pepsin-solubilized collagens from the skin of balloon fish (Diodon holocanthus)[J]. Food Hydrocolloids, 2011, 25 (6): 1507-1513.

[14] NAGAI T, SUZUKI N. Isolation of collagen from fissh waste material-skin, bone and fins[J]. Food Chemistry, 2000, 68(3): 277-281.

[15] TAKESHI N, EIJI Y, KEI T, et al. Isolation and characterisation of collagen from the outer skin waste material of cuttle fish (Sepia lycidas)[J]. Food Chemistry, 2000, 72 (4): 425-429.

[16] WANG S, DAMODARAN S. Ice-structuring peptides derived from bovine collagen[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(12): 5501-5509.

[17] 張路, 代龍, 楊田義, 等. 酶解法從豬皮中提取膠原的工藝優(yōu)選 [J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑雜志, 2011, 17(4): 8-11.

[18] 周曉蕾, 陳滔滔, 王保懷, 等. 沙冬青抗凍蛋白熱滯活性的DSC研究[N].物理化學(xué)學(xué)報(bào), 2001(1): 66-69.

[19] 張超, 趙曉燕, 馬越, 等. 使用差示掃描量熱儀測(cè)定抗凍蛋白熱滯活性方法的研究[J]. 生物物理學(xué)報(bào), 2008(6): 465-473.

[20] YU S O, BROWN A, MIDDLETON A J, et al. Ice restructuring inhibition activities in antifreeze proteins with distinct differences in thermal hysteresis[J]. Cryobiology, 2010, 61(3): 327-334.

[21] 魏令波, 江勇, 舒念紅, 等. 抄冬青葉片熱穩(wěn)定抗凍蛋白特性分析[J].植物學(xué)報(bào), 1999, 41(8): 837-841.

[22] 盧存福, 王紅, 簡(jiǎn)令成. 植物抗凍蛋白研究進(jìn)展[J]. 生物化學(xué)和生物物理進(jìn)展, 1998, 25(3): 210-216.

[23] 劉麗莉, 馬美湖, 楊協(xié)力. 牛骨Ⅰ型膠原蛋白提取及結(jié)構(gòu)表征[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(2): 87-91.

[24] GELSE K, POSCHL E, AIGNER T. Collagens-structure, function, and biosynthesis[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2003, 55(16): 1531-1546.

[25] 閻繼紅, 劉玲蓉, 李學(xué)敏, 等. 膠原透明質(zhì)酸硫酸軟骨素復(fù)合三維支架體外構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)修復(fù)重建外科雜志, 2006, 20(2): 130-133.

[26] ZHU S M, HOSAHALLI S, ALAIN le BALL E. Ice-crystal formation in gelatin gel during pressure shift versus conventional freezing[J]. Journal of Food Engineering, 2005, 66(1): 69-76.

[27] CORCILIUS L, SANTHAKUMAR G, STONE R S, et al. Synthesis of peptides and glycopeptides with polyproline II helical topology as potential antifreeze molecules[J]. Bioorganic & Medical Chemistry, 2013, 21(1): 3569-3581.

Antifreeze Activity of Collagens from Different Sources

NGUYEN Cong Thanh, CAO Hui*, XU Fei, YU Jin-song
(School of Medical Instruments and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China)

In this study, collagens from different sources were prepared by means of enzymatic hydrolysis, and their purity and amino acid composition were identified. Differential scanning calorimetry (DSC) was used to determine the thermal hysteresis activity (THA), and the ice recrystallization inhibition (IRI) was evaluated by cryomicroscopy. The results showed that all the collagens prepared were typical type I collagen with high purity and molecular weight of about 330 kD. The collagens from different sources had common amino acid composition with glycine, proline and alanine as the most abundant amino acids. Compared with bovine serum albumin (BSA), the T0of pig skin collagen revealed a higher THA value (0.52 ℃), and the ice crystal content φ was equal to or less than 5% at a retention temperature Thof -0.2 ℃. As observed under a microscope, pig skin collagen extracts formed a large number of hexagonal ice crystal, demonstrating the antifreeze activity when compared with chicken skin collagen and fish skin collagen.

antifreeze activity; collagen; thermal hysteresis activity; ice recrystallization inhibition

Q51

A

1002-6630（2014）17-0022-05

10.7506/spkx1002-6630-201417005

2013-09-26

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31201421）；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2013AA102207）

阮功成（1981—），男，博士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)。E-mail：congthanhcnsh@gmail.com

*通信作者：曹慧（1976—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)楣δ苄耘淞霞疤砑觿?。E-mail：caohuian@126.com