陳 鐸，張牧霞

(河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院實驗中心，河北 石家莊050051)

食管癌是最常見的惡性腫瘤之一，我國是食管癌的高發(fā)國家之一，且我國食管癌組織學類型90%以上為鱗癌［1］。食管癌被公認為一種基因性疾病，有多種癌基因和抑癌基因參與了食管癌細胞的增殖及凋亡等。干擾素/維甲酸聯(lián)合應用誘導細胞凋亡相關基因- 19 (gene associated with retinoid-interferon-induced mortality-19，GRIM-19)是GRIMs 家族重要成員，其在多種正常組織中表達，參與干擾素和維甲酸誘導的細胞凋亡［2］。研究［3］表明，GRIM-19 在多種腫瘤組織中表達抑制、表達異?；蛲蛔儭Ｓ嘘PGRIM-19 蛋白在食管鱗癌組織中表達的研究尚未見文獻報道。本研究采用免疫組化技術(shù)檢測食管鱗癌、癌旁不典型增生及正常食管黏膜組織中GRIM-19 蛋白表達，運用TUNEL方法檢測食管鱗癌組織中的細胞凋亡，探討GRIM-19蛋白的異常表達與食管鱗癌發(fā)生及細胞凋亡的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 組織標本來源 68 例食管鱗癌、35 例癌旁不典型增生及68 例正常食管黏膜組織來自安陽市腫瘤醫(yī)院2008年3月至2010年3月手術(shù)切除標本。其中男44 例，女24 例，年齡35 ～75 歲，中位年齡54 歲。浸潤黏膜下層或淺肌層者9 例，浸潤深肌層或外膜層者59 例;伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者20 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者48例;術(shù)前均未接受放、化療。所有標本均經(jīng)病理證實為食管鱗癌(經(jīng)HE 染色證實，癌旁組織中35 例存在不典型增生)，正常食管黏膜組織取自遠端手術(shù)切緣并經(jīng)病理證實。

1.1.2 主要試劑 鼠抗人多克隆GRIM-19 蛋白抗體購自美國Abcam 公司;ZYMED S-P 免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;TUNEL 試劑盒購自德國Roche 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組化主要步驟 免疫組化采用S-P 法，操作步驟按照試劑盒說明書進行。用已知陽性的乳腺癌組織切片作為陽性對照，以PBS 液代替一抗作為陰性對照。

1.2.2 免疫組化結(jié)果判定 GRIM-19 蛋白陽性表達信號主要定位在細胞核或細胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒。參照Formowitz 等［4］的綜合計分法進行結(jié)果評定，以確定蛋白陽性表達。具體方法:高倍鏡視野下計數(shù)500個細胞，計算陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比評分。陽性細胞所占比例＜5%記為0 分，5% ～25%為1 分，26% ～50%為2 分，51% ～75%為3 分，＞75%為4分。染色強度評分，樣本無染色為0 分;呈現(xiàn)淡黃色顆粒，明顯高于背景為1 分;出現(xiàn)淺棕黃色顆粒為2 分;出現(xiàn)大量深棕黃色顆粒為3 分。將樣本兩者得分相加為總分。根據(jù)分數(shù)把樣本界定為4 類:0 ～1 分為陰性(-)，2 ～3 分為弱陽性(+ )，4 ～5 分為中陽性(++)，6 ～7 分為強陽性(+++)。

1.2.3 TUNEL 方法主要步驟 將組織標本進行脫蠟和水化;蛋白酶K(pH 7.4 ～7.8)室溫孵育20 min;滴加TUNEL 反應混合液后37 ℃下在暗濕盒中反應1 h;熒光顯微鏡下計數(shù)凋亡細胞(激發(fā)光波長為450 ～500 nm，檢測波長為515 ～565 nm);滴加50 ～100 μL DAB工作液，室溫下反應10 min，至出現(xiàn)棕色背景為止;蘇木精復染3 min;光學顯微鏡觀察凋亡細胞(共計200～500 個細胞)并拍照。

1.2.4 TUNEL 方法對照組設計 陽性對照:以已知TUNEL 陽性切片做陽性對照。陰性對照:制備TUNEL反應混合液時，不加酶濃縮液。

1.2.5 TUNEL 檢測結(jié)果判定 顯微鏡下觀察到的凋亡細胞核固縮呈圓形或橢圓形，染色呈現(xiàn)棕褐色，陰性細胞核無著色。在鏡下計數(shù)200 個細胞，觀察呈現(xiàn)凋亡陽性的細胞數(shù)，每組選取5 個分布均勻的視野，取平均值，計算細胞凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)=(凋亡細胞數(shù)/200)×100%。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0 進行統(tǒng)計分析，采用χ2檢驗來進行樣本率的比較，相關關系分析用Spearman 相關性分析，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中GRIM-19 蛋白的表達 GRIM-19 蛋白陽性表達信號主要定位于細胞核或細胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒，陽性對照有陽性信號顯示，陰性對照無陽性信號顯示。GRIM-19 蛋白在正常食管黏膜組織、癌旁不典型增生組織及食管鱗癌組織中的陽性表達率分別為80.9%(55/68)、34.3%(12/35)和11.8%(8/68)，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P 均＜0.05)。

2.2 GRIM-19 蛋白表達與腫瘤細胞凋亡的關系 食管鱗癌凋亡細胞核固縮呈圓形或橢圓形，染色呈現(xiàn)棕褐色，陰性細胞核無著色。食管鱗癌組織中腫瘤細胞的凋亡與GRIM-19 蛋白表達有關，GRIM-19 蛋白陽性表達組中腫瘤細胞AI 為(5.06 ±0.93)%，顯著高于陰性表達組的(1.12 ±0.06)%，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

3 討論

GRIM-19 是Kalvakolanu 采用反義RNA 敲除技術(shù)在乳腺癌細胞中篩選鑒定并首先報道的凋亡蛋白［5］，GRIM-19 是GRIMs 家族重要成員，編碼含144 個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量約16 000，定位于19p13.1。GRIM-19 是一種保守基因，在多種正常組織中表達，參與干擾素和維甲酸誘導的細胞凋亡［2］。GRIM-19 蛋白的異常表達激活細胞的凋亡過程，但僅僅GRIM-19 蛋白的異常表達并不足以引起細胞凋亡，GRIM-19 蛋白的異常表達可以增加細胞對干擾素和維甲酸誘導的凋亡的敏感性，同時，GRIM-19 蛋白是一種小的核蛋白，可能協(xié)助轉(zhuǎn)運凋亡激活蛋白進入細胞核，GRIM-19 蛋白的羧基端對其誘導細胞凋亡是必不可少的，其表達降低或位點突變可以導致細胞的異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化［6］。研究［3］表明GRIM-19 在多種腫瘤組織中表達抑制、表達異?；蛲蛔?。

GRIM-19 在正常細胞中的表達可以維持細胞正常的生活周期，促使衰老細胞凋亡，其基因突變、缺失或表達下調(diào)均可引起細胞發(fā)生異常增殖。目前GRIM-19對細胞增殖和凋亡的影響日益受到重視，但文獻［7-12］報道多集中在GRIM-19 異常表達與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系方面。有關GRIM-19 異常表達與腫瘤細胞凋亡關系的研究相對較少，GRIM-19 異常表達與食管癌細胞凋亡關系的研究尚未見文獻報道。本研究運用免疫組化技術(shù)檢測68 例食管鱗癌、35 例癌旁不典型增生及68 例正常食管黏膜組織中GRIM-19 蛋白表達，并采用TUNEL 方法檢測食管鱗癌組織中的細胞凋亡。結(jié)果顯示，GRIM-19 蛋白在正常食管黏膜組織、癌旁不典型增生組織及食管鱗癌組織中的陽性表達率依次降低;GRIM-19 蛋白陽性表達組中腫瘤細胞AI 顯著高于陰性表達組。結(jié)果提示，GRIM-19 蛋白的低表達可能與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展有關，且與食管鱗癌細胞的凋亡相關。該研究結(jié)果為進一步探討食管鱗癌等惡性腫瘤的凋亡機制奠定了一定的理論基礎。

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