朱煥勉，陳 然，薛 峰，申屠楊萍，范小芳，龔永生，張宏宇，孔曉霞Δ

低氧性肺動脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）是慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）、慢性肺源性心臟病等多種心肺疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理環(huán)節(jié)［1］，其發(fā)病機理十分復(fù)雜，是一種以肺血管重構(gòu)（remodeling）為主的不可逆性損害的疾病。

自噬是一種細胞通過溶酶體降解途徑調(diào)控的細胞器和蛋白循環(huán)過程［2，3］，已經(jīng)被證實與衰老、免疫、細胞死亡和分化等病理生理過程的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4］，但細胞自噬在低氧性肺動脈高壓平滑肌細胞增殖中的作用還未被闡明。本實驗應(yīng)用1%氧氣作用于肺動脈平滑肌細胞，觀察自噬抑制劑氯喹在肺動脈平滑肌細胞增殖中作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清等均購于美國Thermo公司?？筁C3、GAPDH單克隆抗體購于美國CST公司。單丹酰戊二胺（monodansylcadaverine，MDC）、氯喹購于美國Sigma公司。

1.2 肺動脈平滑肌細胞的培養(yǎng)及分組

取150～200 g成年Wistar大鼠，購自溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。在無菌條件下打開大鼠胸腔取出肺動脈干和左右肺動脈，組織塊法培養(yǎng)肺動脈平滑肌細胞（pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs），并經(jīng)α-平滑肌肌動蛋白免疫細胞化學(xué)鑒定。培養(yǎng)液為含15%胎牛血清DMEM，取第3～5代細胞用于本實驗。用0.25%胰酶消化細胞并傳代，細胞貼壁并達到（70～80）%融合后，換含0.4% 胎牛血清 DMEM培養(yǎng)基使PASMCs同步生長24 h，按照實驗分組進行加藥處理，并分別放入常氧（21%O2）和低氧（1%O2）孵箱（德國賀氏公司），24 h后進行各指標的檢測。

1.3 亞甲基四唑藍（MTT）測定PASMCs增殖

取原代培養(yǎng)的3～5代對數(shù)生長期PASMCs，經(jīng)胰酶消化制成細胞懸液，以每孔 100μl（1×104cells）接種于 96孔板，培養(yǎng) 24 h后加入 50μmol／L氯喹，于 20 h后加入 MTT（5 g／L）20μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后吸出培養(yǎng)液，加入 DMSO 150μl，振蕩 10 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm下測其吸光度值。

1.4 MDC熒光染色檢測自噬變化

單丹（磺）酰戊二胺（MDC）是一種自噬空泡的標志物，組織塊法培養(yǎng)PASMCs經(jīng)消化制成細胞懸液，以每孔5×104細胞數(shù)接種于24孔板中玻片上，細胞貼壁后，按照實驗分為4組：正常對照組、1%低氧組、50μmol／L氯喹＋低氧組、氯喹組。藥物和／或低氧處理24 h后，PBS洗2遍，棄上清，以4%冰冷的多聚甲醛4°C固定15 min，PBS洗2遍，加入終濃度為 50μmol／L的 MDC，37°C孵育 50 min，PBS洗 2遍。甘油封片，熒光顯微鏡下（Nikon ECLPSE 80i）觀察細胞自噬空泡積聚的變化。

1.5 肺動脈平滑肌細胞中LC3蛋白表達

LC3是自噬過程中的關(guān)鍵蛋白之一，是自噬體形成雙層膜結(jié)構(gòu)的主要組成部分。在自噬激活時，LC3-I（18 kDa）會被水解切割為 LC3-II（16 kDa），被廣泛用來衡量細胞自噬激活水平。以LC3-II／LC3-I比值反映LC3蛋白相對水平變化，作為衡量細胞自噬水平的標準之一。6 cm培養(yǎng)皿中不同組別的PASMCs加入100μL RIPA細胞裂解液，反復(fù)吹打后置冰浴 30 min，12 000 r／min，4°C離心 30 min，取上清，應(yīng)用BIO-RAD法測定蛋白含量。取蛋白30μg做SDS-PAGE電泳，將蛋白樣本轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。取出膜后用5%脫脂奶粉封閉1 h，PBST洗3次，加入抗 LC3抗體（1∶1 000），4°C孵育過夜。次日，PBST洗3次，相應(yīng)加入過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（1∶2 000），放在脫色搖床搖1 h，PBST洗3次。ECL顯色，BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。以GAPDH為內(nèi)參蛋白，實驗重復(fù)3次。

1.6 劃痕法檢測PASMCs遷移

組織塊法培養(yǎng)PASMCs經(jīng)消化制成細胞懸液，以每孔5×104細胞數(shù)接種于24孔板中，細胞貼壁后，待細胞生長至80%融合后，用無菌200μl的移液器吸頭劃痕，吸去原有15%FBS培養(yǎng)液，去除因劃痕引起的飄散細胞，分別按照實驗分組處理24 h后，用倒置相差顯微鏡觀察、拍照，每條劃痕隨機取3處用共聚焦軟件測量劃痕區(qū)域內(nèi)兩側(cè)細胞邊緣的距離，每組設(shè)6個復(fù)孔。具體方法參照文獻［5］。在劃痕實驗開始時，即0 h，設(shè)定劃痕區(qū)域內(nèi)兩側(cè)細胞邊緣的距離為L0；經(jīng)過24 h后，劃痕區(qū)域內(nèi)兩側(cè)細胞邊緣的距離為L24。則該細胞的遷移距離為：D24＝L0-L24。以該視野內(nèi)細胞的遷移距離的平均數(shù)為準。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差（ˉx±s）表示，采用SPSS 15.0軟件處理。多組間的比較采用單因素方差分析，組間差異比較采用q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 氯喹對低氧PASMCs增殖的影響

MTT結(jié)果表明：與對照組相比，單獨應(yīng)用自噬抑制劑氯喹，PASMCs細胞增殖率變化不明顯（P＞0.05）；1%低氧24 h促進肺動脈平滑肌細胞增殖，為（114.2±4.6）%（P＜0.05）；50μmol／L氯喹作用于低氧誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌細胞24 h后，明顯抑制了低氧誘導(dǎo)的細胞增殖，為（105.6±7.3）%（P＜0.05，圖 1）。

Fig.1 Vitality of PASMCs treated with hypoxia and／or CQ for 24 hCQ：Chloroquine*P＜0.05 vs control group；＃P＜0.05 vs hypoxia group

2.2 氯喹對低氧PASMCs遷移能力的影響

與對照組相比，1%低氧24 h能促進肺動脈平滑肌細胞遷移（65.2±4.8）μm（P＜0.05）。與低氧組相比，應(yīng)用自噬抑制劑氯喹抑制了低氧誘導(dǎo)的細胞遷移（26.3±2.1）μm（P＜0.05）。單獨應(yīng)用氯喹細胞遷移無明顯變化（21.5±1.9）μm（P＞0.05，圖2）。

Fig.2 Cell migration of PASMCs with wound healing migration assayA：Cells images results by light microscope；B：Statistical analysis graph；PASMCs：Pulmonary arterial smooth muscle cells；CQ：Chloroquine*P＜0.05 vs control group；＃P＜0.05 vs hypoxia group

2.3 氯喹對低氧PASMCs自噬空泡的影響

肺動脈平滑肌細胞放置于1%低氧培養(yǎng)箱中24 h，MDC熒光染色信號顯著增強，大量自噬空泡積聚，與對照組相比顯著增加，熒光定量分析平均熒光強度為（195.1±10.9）%（P＜0.01），表明低氧引起了細胞自噬的發(fā)生；而自噬抑制劑氯喹與低氧聯(lián)合作用時，與低氧組相比自噬空泡增加更加明顯，平均熒光強度為 （310.3±5.8）%（P＜0.05，圖 3），說明作用于溶酶體的自噬抑制劑氯喹，抑制了低氧條件下的自噬體降解過程，導(dǎo)致了自噬空泡結(jié)構(gòu)的積聚增加，抑制了自噬晚期的溶酶體融合與降解過程。

2.4 氯喹對低氧PASMCs自噬蛋白LC3表達的影響

與正常對照組相比，肺動脈平滑肌細胞低氧24 h，細胞 LC3-II蛋白表達增強，LC3-II／LC3-I比值為（0.31±0.06）（P＜0.05）。與低氧組相比，當自噬抑制劑氯喹與低氧聯(lián)合應(yīng)用后，細胞LC3-II蛋白表達增加明顯，LC3-II／LC3-I比值為 （0.63±0.02）（P＜0.05，圖4）。說明應(yīng)用自噬抑制劑氯喹明顯增加了低氧誘導(dǎo)的自噬標志性蛋白LC3II的表達，表明由細胞自噬體形成過程被顯著抑制。

Fig.3 Autophagic vacuoles detected by fluorescence microscope in PASMCsA：MDCfluorescent staining images（×1 000）；B：Statistical analysis graph；PASMCs：Pulmonary arterial smooth muscle cells；CQ：Chloroquine**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05 vs hypoxia group

Fig.4 Detection of LC3 protein expression by Western blot and the ratio of LC3-II to LC3-I in PASMCs A：Western blot analysis results；B：Relative ratio of LC3-II／LC3-I；PASMCs：Pulmonary arterial smooth muscle cells；LC3：Microtubule-associated protein-1 light chain 3*P＜0.05 vs control group；＃P＜0.05 vs hypoxia group

3 討論

低氧性肺動脈高壓的發(fā)病機理十分復(fù)雜，涉及多因素、多因子調(diào)節(jié)的一系列病理過程［6］。主要以肺動脈平滑肌細胞增生、肥大、遷移、中膜增厚、外周小血管肌化、細胞外基質(zhì)異常堆積為主，肺動脈平滑肌增殖是肺血管重塑的直接因素。有研究表明，1%低氧作用于肺動脈平滑肌細胞，促進細胞增殖［7］。與本實驗MTT結(jié)果一致：低氧下，肺動脈平滑肌細胞增殖率明顯上升。同時我們應(yīng)用細胞劃痕實驗對細胞遷移進行檢測，結(jié)果表明低氧處理肺動脈平滑肌細胞24 h，細胞遷移速度明顯增加。說明在低氧模型下，平滑肌細胞增殖和遷移與肺動脈高壓疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

自噬既可以作為適應(yīng)性機制，清除老化的、錯誤折疊的蛋白和受損的細胞器（如線粒體），并且能夠在一定程度上促進細胞增殖和遷移［8］。而過度激活的自噬導(dǎo)致的細胞死亡即自噬性細胞死亡，加速疾病的發(fā)展和惡化［9，10］。研究表明，低氧能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細胞發(fā)生自噬［11］。在COPD病人的肺組織樣本中，自噬蛋白Beclin1和LC3表達明顯增加［12］。此外，CSE誘導(dǎo)的臍帶靜脈內(nèi)皮細胞損傷模型中，自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenin，3-MA）和自噬調(diào)節(jié)基因ATG5沉默都能夠顯著延緩內(nèi)皮細胞死亡過程［13］。不過，細胞自噬在低氧性肺血管平滑肌細胞增殖中的作用還需進一步探討。研究表明，氯喹能夠通過改變?nèi)苊阁w功能，阻斷自噬相關(guān)的溶酶體融合和代謝過程［14］。利用 Sonic hedgehog（Shh）誘導(dǎo)的心血管平滑肌細胞增殖中，利用自噬抑制劑3-MA或ATG7的siRNA，都能夠明顯降低細胞的增殖和遷移過程［15］。通過ATG5的siRNA技術(shù)，能夠顯著抑制野百合堿模型里小鼠肺動脈平滑肌的增殖過程，而且體內(nèi)和體外實驗中也表明這一過程與自噬進程和溶酶體相關(guān)的代謝調(diào)控密切相關(guān)［16］。本實驗MDC染色結(jié)果表明，肺動脈平滑肌細胞在1%低氧作用24 h后有大量自噬空泡積聚，而應(yīng)用自噬抑制劑氯喹加劇了低氧誘導(dǎo)的自噬空泡積聚。同時LC3-II蛋白表達增強，而氯喹明顯加強了低氧引起的LC3-II的表達，與MDC染色結(jié)果一致，推測自噬抑制劑氯喹可能通過抑制自噬體與溶酶體的融合過程，即抑制了自噬溶酶體功能從而抑制降解過程，最終導(dǎo)致自噬空泡的過度積聚從而抑制自噬的進程。而MTT結(jié)果和劃痕實驗結(jié)果表明，自噬抑制劑氯喹抑制了低氧引起的促細胞增殖和遷移效應(yīng)。以上結(jié)果說明氯喹能夠抑制低氧引起的肺動脈平滑肌細胞自噬，進而抑制低氧引起肺動脈平滑肌細胞增殖和遷移的水平，我們推測這很可能是通過影響自噬溶酶體的功能和進一步的蛋白代謝過程來發(fā)揮調(diào)控作用的。

綜上所述，我們推測在低氧作用的肺動脈平滑肌細胞增殖過程中，自噬可能作為一種適應(yīng)性機制，通過降解以及再循環(huán)細胞內(nèi)代謝產(chǎn)物等來提供能量發(fā)揮促進細胞增殖與遷移作用，這成為肺動脈高壓病理生理過程和血管重構(gòu)的一個重要環(huán)節(jié)。而自噬抑制劑氯喹則通過影響溶酶體功能，影響自噬相關(guān)的代謝功能，從而達到抑制低氧對肺動脈平滑肌細胞增殖的促進作用，相關(guān)理論仍有待于深入的探討。本實驗的研究結(jié)果為擴展低氧性肺動脈高壓疾病的研究和藥物治療理論基礎(chǔ)，也為氯喹的新適應(yīng)癥的開發(fā)提供了全新的思路。

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