馬 駿，方以群，王芳芳，李開誠

（海軍醫(yī)學研究所，上海200433）

氧氣被廣泛的應用于治療臨床疾病和潛水作業(yè)，但是當機體過長時間呼吸高分壓氧氣會導致肺型氧中毒。高分壓氧氣在肺組織內產生過量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），損傷肺組織上皮細胞和血管內皮細胞，炎性細胞滲入肺泡，形成炎癥，影響肺組織氣體交換，最終可能造成死亡。這是肺型氧中毒的一般的病理生理過程。新近的研究表明發(fā)生肺型氧中毒的動物肺組織中凋亡細胞數量有明顯的增加，提示了細胞凋亡在肺型氧中毒的發(fā)病過程當中起著重要的作用。但是這種情況下的細胞凋亡是如何調控的，目前還缺乏充分的研究。

蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）屬于絲氨酸／蘇氨酸激酶家族。PKC有至少10個亞基，在不同組織中有不同的表達。PKC分為三組：（1）經典 PKC：包含α，βI，βII，γ；（2）新型 PKC：包含δ，ε，η，θ；（3）非典型 PKC：包含ζ，λ。PKC的激活出現在各種病理變化中，如：腫瘤、疼痛、糖尿病、中風、早老性癡呆以及心力衰竭等疾病。研究表明PKCδ的活化參與了細胞凋亡的調控［1］。這種調控表現為促進細胞凋亡和抑制細胞凋亡兩方面。在肺型氧中毒的細胞凋亡過程中是否有PKCδ的活化，目前還沒有研究。本研究初步探討肺組織中的PKCδ在氧中毒下活性變化。

1 材料與方法

1.1 儀器與藥品

小型實驗用動物氧艙（海軍醫(yī)學研究所），液氮罐（YDS-35-125，四川亞西機器廠），超低溫冰箱（ULT-1386-3-V，Thermo），高速離心機（3k30，SIGMA）。

1.2 實驗動物

雄性SD大鼠，30只，體重200 g左右，購于復旦大學實驗動物科學部。

1.3 實驗分組

隨機將大鼠分為對照組和2.3ATA純氧暴露2、6、10 h組和常氧高分壓氮組（n＝6）。

1.4 處理方法

對照組和實驗組動物均正常飲食，在氧艙內適應1 d后進行實驗。對照組不進行純氧暴露，不經過加壓及減壓程序，在艙內適應結束后即處死取材。2.3ATA純氧暴露的動物在艙內經過適應后，在艙內放置鈉石灰，關閉艙門，純氧通風。測氧濃度大于99%后停止通風并立即加壓，經10 min勻速加壓至2.3ATA，停止加壓，小流量通風并保持艙內壓力不變，每20 min測量艙內氧氣濃度和二氧化碳濃度，使氧濃度大于99%，二氧化碳濃度小于0.05%。不同實驗組分別在此條件下暴露2、6、10 h，然后經5 min減壓至160 kPa并停留5 min，再經5 min減壓至130 kPa并停留5 min，再經5 min減壓出艙。常氧高壓氮組小鼠擬排除壓力作用，應用常氧高壓氮混合氣加壓，氮氣濃度為91%，二氧化碳濃度小于0.05%，暴露10 h，減壓前應用壓縮空氣置換艙內的氮氧混合氣，加減壓程序同2.3ATA純氧暴露組。

1.5 取材方法

動物出艙后用0.1%戊巴比妥1 ml麻醉，腹主動脈放血處死，開胸取肺組織0.1 g左右，去除肺組織表面血污，置入液氮速凍，后轉入超低溫冰箱保存，準備進一步處理。

1.6 免疫印跡法

大鼠肺組織，用 RIPA（50 mmol／L Tris，150 mmol／L NaCl，0.1%Triton-100，10%glycerol，0.5 mg／ml BSA and protease inhibitors）4℃裂解。樣品處理后進行SDS-PAGE電泳，再被轉移到多聚二氟乙烯膜上，膜用含5%脫脂牛奶和0.1%Tween 20的TBST緩沖液封閉1 h（室溫）。然后分別按需要使用PKCδ、p-PKCδ抗體 1∶2 000，購自 Sigma公司）、小鼠抗肌動蛋白抗體 （1∶50 000；Chemicon），在 4℃條件下雜交過夜。用連有辣根過氧化物酶的相應二抗雜交，并用TBST漂洗之后，由ECL顯影液顯影曝光。

用ImageQuant 5.1測定蛋白雜交的ECL信號強度，計算上述分子與肌動蛋白強度之間的比值。以每次實驗相應的對照組進行標準化。

1.7 統計分析

本實驗所有數據以均數±標準差（ˉx±s）表示，應用SPSS軟件包對樣本進行方差分析。

2 結果

研究發(fā)現，在 2.3 ATA的純氧處理 2、6、10 h，同時以未處理和2.3 ATA的常氧高分壓氮氣處理10 h的大鼠為對照，2.3 ATA純氧處理 2 h，大鼠肺組織p-PKCδ有所降低；暴露6 h、大鼠肺組織p-PKCδ明顯降低；處理時間 10 h、大鼠肺組織p-PKCδ有所恢復。而對照組中肺組織p-PKCδ無明顯改變。各組間PKCδ表達量沒有明顯差別（圖1）

Fig.1 Effect of hyperbaric oxygen on PKCδactivity in rat lung*P＜0.05 vs control group

3 討論

在我們的前期研究當中發(fā)現隨著純氧暴露時間的延長，動物肺組織水腫程度加重，血細胞滲出增多，提示了肺型氧中毒程度逐漸加深［2］。隨著肺型氧中毒程度的加深，PKCδ的表達含量并沒有明顯的變化。但是其活性形式p-PKCδ的含量在0～6 h時逐漸降低，提示其活化受到抑制；6 h后含量逐漸恢復，這可能是抑制活化因素解除或者促進活化因素增強造成的。結合肺組織在6 h后遭到嚴重的破壞的前期實驗結果，抑制因素由于組織細胞的破壞而解除的可能性更大。

組織內過量的ROS可以直接對細胞產生毒性作用，導致細胞壞死和細胞凋亡。研究表明肺泡上皮細胞和血管內皮細胞發(fā)生細胞凋亡在肺型氧中毒的發(fā)病過程當中起著重要的作用［3］。而PKCδ可以對細胞凋亡過程進行調節(jié)，從而控制個體的發(fā)育和疾病的進程。研究表明PKCδ可以通過3種方式活化：與甘油二酯（DAG）結合、經蛋白酶水解和磷酸化?；罨腜KCδ在特定的細胞、特定的環(huán)境下可以表現為抑制細胞增殖、促進或抑制細胞凋亡等作用［4］，從而參與到機體的病理生理過程當中。我們的研究發(fā)現氧中毒后，p-PKCδ在2.3ATA處理2 h就有輕微的降低，6 h就降到最低，到了處理10 h，反而有所恢復。這與我們前期在背根神經節(jié)上氧中毒后ERK變化一致，但遲于細胞凋亡的變化［5］。p-PKCδ的變化提示其在肺型氧中毒的發(fā)生過程中可能起到抑制細胞凋亡的作用，從而減輕組織的氧化損傷。氧中毒后 p-PKCδ與正常相比是降低的，而在其它疾病中，PKC往往是被激活的。這里面可能存在不同的作用機制需要我們更進一步的研究。

［1］ Brodie C，Blumberg PM.Regulation of cell apoptosis by protein kinase c delta［J］.Apoptosis，2003，8（1）：19-27.

［2］ 馬 駿，方以群，孟 淼，等.230 kpa純氧暴露不同時程小鼠肺組織tlr4基因表達變化［J］.中華航海醫(yī)學與高氣壓醫(yī)學雜志，2010，17（1）：13-15.

［3］ Pagano A，Barazzone-Argiroffo C.Alveolar cell death in hyperoxia-induced lung injury［J］.Ann N Y Acad Sci，2003，1010：405-416.

［4］ Zhao M，Xia L，Chen GQ.Protein kinase cdelta in apoptosis：A brief overview［J］.Arch Immunol Ther Exp（Warsz），2012，60（5）：361-372.

［5］ Li KC，Bao XC，Fang YQ，et al.Different activation of ERK1／2 and p38 with hyperbaric oxygen in dorsal root ganglion［J］.Undersea Hyperb Med，2011，38（2）：149-153.