黃景慧，韓文志，金 鑫，劉 衛(wèi)，汪 海

低氧暴露嚴(yán)重影響人體的健康，其對(duì)機(jī)體的影響，取決于發(fā)生的程度、速度、持續(xù)時(shí)間和機(jī)體的功能代謝狀態(tài)［1］。如急性嚴(yán)重低氧暴露，可導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)代償不全和功能障礙，引起重要器官產(chǎn)生不可逆損傷甚至死亡［2，3］。盡管發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但研究已證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞損傷及其功能異常在低氧暴露損傷發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用［3，4］。研究顯示，急性低氧暴露可導(dǎo)致肺微小動(dòng)脈強(qiáng)烈收縮，形成不均勻局部灌注，造成肺泡阻力血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，引起肺動(dòng)脈強(qiáng)烈收縮，誘發(fā)肺動(dòng)脈壓升高［1，2］；而腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)低氧暴露更是十分敏感，極易受損，受損的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞是導(dǎo)致血腦屏障通透性增加，腦脊液緩沖不充分，誘發(fā)低氧腦損傷的重要原因［2］。目前針對(duì)低氧內(nèi)皮細(xì)胞損傷，尚缺乏較好的解決方案。因此，研究靶向調(diào)控低氧暴露的肺和腦微小動(dòng)脈，強(qiáng)效保護(hù)微血管內(nèi)皮功能的藥物具有重要臨床意義。

埃他卡林（iptkalim，Ipt）是新型的 KATP通道開放劑［5］，我室前期在內(nèi)皮素（endothelin-1，ET-1）誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓模型［6］及模擬慢性低氧性肺動(dòng)脈高壓［7］的動(dòng)物模型上均發(fā)現(xiàn)，Ipt可以有效阻止肺動(dòng)脈高壓持續(xù)增高和逆轉(zhuǎn)持續(xù)低氧所致的大鼠肺微小動(dòng)脈重構(gòu)，改善間歇性低氧暴露肺微小動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能［6］。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，利用阻力血管張力研究平臺(tái)［8］，將進(jìn)一步探討低氧暴露狀態(tài)大鼠腦和肺微動(dòng)脈內(nèi)皮功能及Ipt對(duì)低氧暴露腦和肺微動(dòng)脈的擴(kuò)張作用特征，為Ipt發(fā)展為通過(guò)改善低氧暴露狀態(tài)下微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能防治低氧損傷的藥物研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

二級(jí)雄性SD大鼠，體重（200±20）g（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供），分籠飼養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食。隨機(jī)分為 2組：常壓常氧組（control），低氧暴露組（hypoxia）。

1.2 低氧處理

將低氧暴露組大鼠置于常壓低氧艙內(nèi)8 h，低氧開始時(shí)，先向艙內(nèi)充入氮?dú)?，降低艙?nèi)氧氣含量，艙內(nèi)氧濃度由氧濃度監(jiān)測(cè)儀（CYES-II；中國(guó)上海）監(jiān)測(cè)，模擬 7 000 m（7.8%O2），低氧艙有小孔與外界相通，使氧艙大氣壓與外界一致。艙內(nèi)CO2和水蒸氣分別用鈉石灰和無(wú)水氯化鈣吸收。

1.3 Ipt對(duì)低氧暴露預(yù)收縮腦和肺微動(dòng)脈模型張力變化測(cè)定

將兩組大鼠斷頸處死后，迅速取出肺組織置于4℃的含 Krebs-ringer營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)皿，營(yíng)養(yǎng)液組分（mmol／L）：NaCl 118.3，KCl 4.7，CaCl22.5，KH2PO41.2，NaHCO325.0，MgSO41.2，EDTA 0.026，Glucose 11.1。固定分離腦基底動(dòng)脈及肺4～5級(jí)微動(dòng)脈，管徑為（204±5）μm，制備約2 mm的微動(dòng)脈血管環(huán)，記錄微動(dòng)脈管徑。將微動(dòng)脈環(huán)懸掛于DMT 610 m微血管張力測(cè)定儀的37℃恒溫浴槽內(nèi)，持續(xù)通入95%O2和5%CO2混和氣，通過(guò)Powerlab記錄系統(tǒng)監(jiān)測(cè)肺動(dòng)脈環(huán)張力變化。在6 nmol／L ET-1預(yù)致血管收縮的條件下，選取張力大于3 mN功能良好的微動(dòng)脈，累積性給予 Ipt（（10-11～10-3）mol／L，北京賽德維康醫(yī)藥研究院合成、提供，純度＞99.5%）。待每一次給藥濃度的張力示數(shù)穩(wěn)定后再給予下一濃度，觀察不同濃度的藥物對(duì)血管張力的影響并利用乙酰膽堿（acetycholine，ACh）考察微動(dòng)脈內(nèi)皮功能。以 ET-1誘發(fā)最大穩(wěn)定收縮幅度為100%，藥物誘發(fā)血管擴(kuò)張的幅度與ET-1誘發(fā)最大穩(wěn)定收縮幅度之間的比率為血管的擴(kuò)張率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示。運(yùn)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），再進(jìn)行 q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 低氧暴露對(duì)微動(dòng)脈內(nèi)皮功能的影響

以6 nmol／L ET-1預(yù)收縮腦基底動(dòng)脈及肺微動(dòng)脈，模型穩(wěn)定后以10μmol／L ACh檢驗(yàn)低氧暴露腦和肺微動(dòng)脈內(nèi)皮功能。結(jié)果顯示：與常壓常氧組（control）擴(kuò)張率（21.42±3.14）%對(duì)比，ACh對(duì)低氧腦基底動(dòng)脈擴(kuò)張率顯著降低（P＜0.01，圖 1A），僅為（5.79±3.53）%；ACh對(duì)常壓常氧組肺微動(dòng)脈擴(kuò)張率為（18.13±3.38）%，而對(duì)低氧暴露組擴(kuò)張率也明顯降低至（11.77±2.21）% （P＜0.05，圖 1B）。提示低氧暴露導(dǎo)致腦和肺微小動(dòng)脈內(nèi)皮功能受損。

Fig.1 Vasodilator response of basilar arteries（A）and pulmonary arterioles（B）to acetylcholine（ACh）pre-contracted by 6nmol／L ET-1（ˉx±s，n＝9）ET-1：Endothelin-1*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Fig.2 Vasodilator response of basilar arteries（A）and pulmonary arterioles（B）to iptakalim（Ipt）pre-contracted by 6 nmol／LET-1（ˉx±s，n＝9）ET-1：Endothelin-1*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

2.2 Ipt對(duì)低氧暴露微動(dòng)脈的擴(kuò)張作用特征

以 6 nmol／L內(nèi)皮素-1（ET-1）預(yù)收縮腦和肺微動(dòng)脈，模型穩(wěn)定后，累積性加入 Ipt。結(jié)果顯示，Ipt對(duì)常壓常氧組及低氧暴露組腦基底動(dòng)脈也呈劑量依賴性擴(kuò)張作用，最大擴(kuò)張率分別為（29.91±3.16）%和（31.41±2.64）%，兩組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05，圖2A）；Ipt對(duì)常壓常氧組肺微動(dòng)脈最大擴(kuò)張率為（16.85±2.48）%，對(duì)常壓低氧組肺微動(dòng)脈呈劑量依賴性擴(kuò)張反應(yīng)，最大擴(kuò)張率為（27.17±4.07）%，與常壓常氧組相比有顯著性差異（P＜0.01，圖2B）。提示Ipt對(duì)常壓常氧暴露的腦阻力血管擴(kuò)張作用較弱，而對(duì)低氧暴露的大鼠肺微動(dòng)脈更敏感，擴(kuò)張作用更強(qiáng)。

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道模擬7 000 m高原低氧（7.8%O2）8 h，可以誘導(dǎo)大鼠肺組織含水量明顯升高，肺微動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞受損，ET-1增加而NO明顯減少，造成內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)血管平滑肌的調(diào)節(jié)紊亂，血管平滑肌異常增殖等肺微動(dòng)脈的病理改變［7］。在低氧腦損傷形成過(guò)程中，大鼠大腦皮層ET-1蛋白表達(dá)明顯升高，腦微血管內(nèi)皮功能的損傷［3］。本研究將大鼠置于低氣壓艙內(nèi)暴露于 7 000 m（7.8%O2）低氧 8 h，發(fā)現(xiàn) ACh對(duì)急性低氧暴露狀態(tài)的腦、肺微動(dòng)脈擴(kuò)張率與常壓常氧組相比均顯著降低，說(shuō)明急性低氧暴露大鼠腦和肺微血管均存在明顯的內(nèi)皮功能損傷，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致。因此，靶向調(diào)控急性低氧暴露的肺和腦微小動(dòng)脈，強(qiáng)效保護(hù)肺和腦微血管內(nèi)皮功能的藥物能夠有效預(yù)防低氧損傷的作用。

前期實(shí)驗(yàn)表明，Ipt作為新型 KATP通道開放劑［10］，可以阻斷ET-1誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓，逆轉(zhuǎn)低氧所致的動(dòng)物肺動(dòng)脈高壓和肺小動(dòng)脈重構(gòu)［6］，近期研究還發(fā)現(xiàn)，Ipt可以改善間歇性低氧暴露狀態(tài)的肺微動(dòng)脈內(nèi)皮功能，對(duì)肺微動(dòng)脈具有明顯的劑量依賴性的擴(kuò)張作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，常壓低氧暴露 （7.8%O2）8 h后，Ipt對(duì)肺微動(dòng)脈的劑量依賴性擴(kuò)張反應(yīng)明顯強(qiáng)于常壓常氧組，而對(duì)腦微動(dòng)脈的劑量依賴性擴(kuò)張反應(yīng)與常壓常氧組無(wú)顯著差異，提示Ipt對(duì)低氧暴露的肺微動(dòng)脈起效濃度低，擴(kuò)張作用更強(qiáng)，具有明顯的病理狀態(tài)選擇性；同時(shí)并不影響低氧暴露內(nèi)皮功能受損的腦基底動(dòng)脈的擴(kuò)張作用，具有明顯的組織選擇性。Ipt對(duì)低氧暴露肺、腦微動(dòng)脈的選擇性擴(kuò)張作用可能與不同組織的血管平滑肌細(xì)胞KATP通道亞單位基因表達(dá)存在差異有關(guān)［9］，具體機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

綜合本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果［5，6］，Ipt高選擇性擴(kuò)張低氧暴露狀態(tài)下內(nèi)皮功能受損的肺微動(dòng)脈的機(jī)制可能在于：激活病理狀態(tài)肺阻力血管細(xì)胞膜KATP通道，引起細(xì)胞膜超極化，抑制Ca2＋內(nèi)流，松弛血管平滑?。?］；同時(shí)糾正肺阻力血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，抑制ET-1等縮血管活性物質(zhì)的釋放，促進(jìn)血管舒張因子（NO）等物質(zhì)的釋放［6、10］，間接擴(kuò)張肺微動(dòng)脈平滑肌，改善肺動(dòng)脈高壓的病理狀態(tài)。低氧暴露導(dǎo)致腦、肺微動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能受損，Ipt具有選擇性增強(qiáng)擴(kuò)張低氧暴露肺微動(dòng)脈的作用特征，其可能發(fā)展為治療低氧肺動(dòng)脈高壓，保護(hù)低氧狀態(tài)肺微動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能的新型藥物。

［1］ West JB.The Physiologic basis of high-altitude diseases［J］.Ann Intern Med，2004，141（10）：789-800.

［2］ KallenbergK，Bailey DM，Christ S，et al.Magnetic resonance imaging evidence of cytotoxic cerebral edema in acute mountain sickness［J］.J cereb blood flow metab，2007，27（5）：1064-1071.

［3］ Basnyat B.High altitude cerebra land pulmonary edema［J］.Travel Med Infect Dis，2005，3（4）：199-211.

［4］ Moudgil R，Miehelakis ED，Areher SL.Hypoxic pulmonary vasoconstriction［J］.J Appl Physiol，2005，98（1）：390-403.

［5］ Wang H，Tang Y，Wang L，et al.ATP-sensitive potassium channel openers and 2，3-dimethyl-2-butylamine derivatives［J］.Curr Med Chem，2007，14（2）：133-155.

［6］ 解衛(wèi)平，王 虹，汪 海，等.ATP敏感性鉀通道開放劑埃他卡林對(duì)大鼠低氧性肺動(dòng)脈高壓的影響［J］.中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2003，19（1）：4-6.

［7］ Kanazawa F，Nakanishi K，Osada H，et al.Expression of endothelin-1 in the brain and lung of rats exposed to Permanent hypobaric hypoxia［J］.Brain Res，2005，1036（1-2）：145-154.

［8］ Ko EA，Song MY，Donthamsetty R，et al.Tension Measurement in Isolated Rat and Mouse Pulmonary Artery［J］.Drug Discov Today Dis Models，2010，7（3-4）：123-130.

［9］ Cao K，Tang G，Hu D，et al.Molecular basis of ATPsensitive K＋channels in rat vascular smooth muscles［J］.Biochem Biophys Res Commun，2002，296（2）：463-469.

［10］ Wang H，Long CL，Duan ZB，et al.A new ATP-sensitive potassium channel opener protects endothelial function in cultured aortic endothelial cells［J］.Cardiovasc Res，2007，73（3）：497-503.