陳小良 廉姜芳 周建慶

冠心病生物標(biāo)記物血清microRNA的研究進(jìn)展

陳小良 廉姜芳 周建慶

microRNA（miRNA）是一類長度約21～24個核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA，在基因轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮細(xì)胞生長調(diào)控作用。miRNA不僅在細(xì)胞分化、生長、凋亡及機(jī)體的正常發(fā)育中發(fā)揮重要作用，還參與包括冠心病、心律失常、心力衰竭等多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過程[1-2]。研究表明miRNA可在血清中穩(wěn)定存在，與組織標(biāo)本來源的miRNA相比，血清miRNA具有采樣方便、穩(wěn)定性好、靈敏度高、可連續(xù)監(jiān)測等優(yōu)勢，成為近年冠心病早期診斷標(biāo)記物的研究熱點之一。本文就血清miRNA作為冠心病診斷標(biāo)記物的研究進(jìn)展作一綜述。

1 血清miRNA概述

相關(guān)研究表明，miRNA可在外周血中穩(wěn)定存在。血液中存在降解RNA的核酸酶，但血清中的miRNA可耐受核酸酶的消化，保持穩(wěn)定[3]。miRNA在室溫、反復(fù)凍融、煮沸、久置、強(qiáng)酸（pH=1）強(qiáng)堿（pH=13）等條件下，均可保持穩(wěn)定[4]。

血清miRNA的來源，目前有學(xué)者認(rèn)為來自于壞死或凋亡的細(xì)胞，細(xì)胞壞死后釋放組織細(xì)胞特異性表達(dá)的miRNA入血，致特定疾病狀態(tài)下特定miRNA表達(dá)的明顯改變；另有學(xué)者認(rèn)為是來自于細(xì)胞主動釋放，miRNA能進(jìn)入微泡、核外體、凋亡體等囊泡中或與Argonaute2（Ago2）蛋白、高密度脂蛋白（HDL）等形成miRNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，通過循環(huán)轉(zhuǎn)移到鄰近或遠(yuǎn)處的受體細(xì)胞進(jìn)而產(chǎn)生生物效應(yīng)[5-7]。

血清miRNA保持穩(wěn)定的機(jī)制主要有：（1）形成微泡：分泌到血液中的miRNA被包裹在脂質(zhì)泡中，形成微泡，從而免受血清中RNA酶的降解，且微泡表面帶有識別靶細(xì)胞的特異性受體或配體，可轉(zhuǎn)運miRNA至靶細(xì)胞，發(fā)揮調(diào)節(jié)功能[5]；（2）形成蛋白復(fù)合物：血清miRNA以蛋白復(fù)合體的形式存在。Arroyo等[6]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與Ago2蛋白結(jié)合形成Ago2-miRNA蛋白復(fù)合體，可保護(hù)miRNA不被RNA酶降解。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，有另兩種miRNA結(jié)合蛋白：核磷蛋白（nucleophosmin 1，NPM1）[8]和HDL[7]也可介導(dǎo)部分miRNA從胞內(nèi)釋放至胞外，并保護(hù)miRNA不被RNA酶降解。miRNA在血清中的穩(wěn)定存在，為血清中miRNA的檢測提供了可能。

2 血清miRNA的檢測方法

目前血清miRNA的檢測方法主要有Northern雜交技術(shù)、實時熒光定量PCR、高通量序列分析法、基因芯片法等。Northern雜交技術(shù)操作繁瑣、樣本量需求大、靈敏度較低，一般不用于臨床樣本的檢測。實時熒光定量PCR具有較高的靈敏度、特異度和重復(fù)性，已成為現(xiàn)階段核酸分子定量檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，可精確地定量分析miRNA的表達(dá),是目前基礎(chǔ)及臨床研究中最常采用的血清miRNA檢測方法。根據(jù)引物的不同，實時熒光定量PCR可以分為莖環(huán)法和加尾法，莖環(huán)法特異度較高。高通量序列分析法具有高通量、準(zhǔn)確度高的特性，但數(shù)據(jù)量大、價格較昂貴，一般只用于新miRNA的篩選。基因芯片法又稱微陣列，具有快速、高通量的特性，但存在背景及混雜信號干擾，重復(fù)性較差，用于miRNA的初篩，其結(jié)果還需采用實時熒光定量PCR等方法加以驗證。

3 血清miRNA用于冠心病診斷的種類與機(jī)制

冠心病作為對人類健康威脅最大的疾病之一，對其作出早期準(zhǔn)確的診斷，并給予積極有效的干預(yù)能夠很好的改善預(yù)后。生物標(biāo)記物的研究在心血管系統(tǒng)疾病中研究最多的就是冠心病，尤其是在急性心肌梗死（AMI）中。雖然心肌肌鈣蛋白（cTn）對心肌壞死具有很高的敏感度及特異度，但對于4h以內(nèi)的AMI診斷仍具有一定的局限性。尋找更為快速、敏感、特異的心肌標(biāo)記物成為目前研究的熱點。最近研究發(fā)現(xiàn)血清中TNF-α和IL-8的表達(dá)水平在心絞痛和心肌梗死中均顯著升高且存在差異性[9]；翁秀妹等[10]也發(fā)現(xiàn)血清骨保護(hù)素水平在慢性冠心病中顯著升高且與冠狀動脈狹窄的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。血清miRNA也有著作為理想標(biāo)記物的重要特征：在外周血中穩(wěn)定存在、獲取簡便、樣本易得、組織及疾病特異性、用實時熒光定量PCR的方法容易測量。目前發(fā)現(xiàn)與冠心病相關(guān)的血清miRNA很多，其中研究較多的有miR-1、miR-133、miR-499、miR-126和miR-155等。

3.1 miR-1 miR-1主要在心肌和骨骼肌中特異性表達(dá)，分為miR-1-1和miR-1-2。miR-1-1主要參與心臟發(fā)育和肌肉分化。Cheng等[11]發(fā)現(xiàn)通過結(jié)扎冠狀動脈左前降支造成AMI的小鼠血清中miR-1水平與對照組相比在心肌梗死后6 h升高了 200倍，心肌梗死3d后miR-1降至正常水平，并且心肌梗死小鼠血清中miR-1水平的升高與其心肌梗死面積呈正相關(guān)。同時，他們通過臨床研究還發(fā)現(xiàn)AMI患者血清miR-1水平與對照組相比在心肌梗死后6h升高了100倍，且其血清miR-1水平的升高與CK-MB水平的升高呈正相關(guān),結(jié)果表明miR-1和CK-MB的表達(dá)水平表現(xiàn)出相同的趨勢。這些預(yù)示著miR-1有可能為AMI新一代的標(biāo)記物。

3.2 miR-133 miR-133有miR-133a和miR-133b兩種亞型，與編碼miR-1的基因處于同一條染色體的相鄰位置，也特異性表達(dá)于心肌和骨骼肌細(xì)胞中，參與多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。

D’Alessandra等[12]的研究發(fā)現(xiàn)大鼠冠狀動脈閉塞6h后，梗死區(qū)miR-1、miR-133的表達(dá)水平均下降；而在血清或血漿中檢測到miR-1、miR-133和miR-499-5p的水平則增高，說明miR-1、miR-133在心肌損傷后才釋放入血，并在心肌梗死患者出現(xiàn)癥狀后156min后即能檢測到miR-1、miR-133高峰值，且此數(shù)值比cTn I峰值來得更高、更早。Eitel等[13]對126例ST段抬高型心肌梗死（STEMI）患者進(jìn)行研究，也發(fā)現(xiàn)血清miR-133a水平的升高與心肌損傷修復(fù)、損傷面積的擴(kuò)大和再灌注損傷密切相關(guān)。這些結(jié)果提示血清miR-133可能是一種有意義的早期診斷AMI的生物標(biāo)記物，對于早期接受手術(shù)治療挽救心肌有至關(guān)重要的意義。

3.3 miR-499 miR-499在肌肉中特異表達(dá)，在肌球蛋白基因調(diào)控中起重要作用。在AMI患者與小鼠AMI模型（冠狀動脈結(jié)扎）血清中miR-133a、miR-1和miR-499-5p的水平均升高。從達(dá)峰時間上看，在AMI的典型癥狀胸痛已發(fā)生而肌酸磷酸激酶（CPK）和cT-nT的水平還未升高時，miR-1和miR-133a的水平已達(dá)峰值[12，14]；而miR-499-5p的峰值延遲至胸痛發(fā)生后6～I(xiàn)2h[12，15]。Li等[16]研究發(fā)現(xiàn),與健康組相比，有 6個miRNAs（miR-1、miR-134、miR-186、miR-208、miR-223、miR-499）均在AMI患者血清中表達(dá)明顯升高，且miR-208、miR-499在心絞痛中表達(dá)更高。上述結(jié)果均表明，miR-499也有作為生物標(biāo)記物診斷冠心病的潛力。

3.4 miR-126和miR-155 miR-126是特異性的內(nèi)皮細(xì)胞的miRNA，參與了內(nèi)皮細(xì)胞的生物合成、血管發(fā)育等過程。Fichtlscherer等[17]通過基因生物芯片對8例冠心病患者和8例健康志愿者血清和血漿中miRNAs表達(dá)譜進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)在冠心病患者中miR-126表達(dá)水平顯著降低；為了進(jìn)一步驗證這些結(jié)果，他們又利用實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測了31例冠心病患者和14例健康志愿者血清中的miR-126和miRNA-155水平，仍然發(fā)現(xiàn)這些miRNAs表達(dá)在冠心病患者中是顯著降低的。Matsumoto等[18]調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，在AMI患者康復(fù)出院后1年內(nèi)發(fā)生心臟死亡事件者血清中miR-155和miR-380的表達(dá)水平分別比健康者高4倍和3倍，這提示miRNAs不僅可以作為診斷疾病的標(biāo)記物，還可以評估預(yù)后，血清miRNAs也許可以列入60歲以上患者入院常規(guī)檢查項目，以篩查不典型AMI，降低病死率。

4 血清miRNA用于診斷冠心病的前景

血清miRNA用于冠心病診斷時具有的優(yōu)勢為：檢測時損傷小、穩(wěn)定性好、靈敏度高、檢測方便、快捷等，而其缺點為血清中miRNA的含量較低，一般方法學(xué)不易檢測。因此，尋找一種靈敏度高、操作簡單且成本低廉的檢測方法是血清miRNA應(yīng)用于冠心病臨床檢測前需進(jìn)一步解決的問題。解決的方法可能有以下幾個方面：（1）選擇合適的內(nèi)參：內(nèi)參的穩(wěn)定性決定了檢測結(jié)果的可靠性，以消除樣品間RNA含量的差異。目前用于冠心病血清樣本檢測的內(nèi)參最常用的有RNU6B和miR-16兩種。（2）選用上調(diào)標(biāo)記物：優(yōu)先選擇在冠心病中表達(dá)上調(diào)的血清miRNA，這樣可提高檢測的靈敏度和特異度。（3）多種標(biāo)記物聯(lián)合使用：僅僅采用一種血清miRNA作為冠心病標(biāo)記物往往特異度不高，若將miRNA與其它類型冠心病標(biāo)記物檢測相結(jié)合，有望顯著提高診斷的準(zhǔn)確性。

總之，雖然相關(guān)研究尚處于起步階段，然而miRNA最新的研究結(jié)果令人驚喜，miRNA具有很強(qiáng)的細(xì)胞、組織或疾病特異性，這些特異性表達(dá)既是其功能研究的基礎(chǔ)，又是很好的疾病標(biāo)記物。相信隨著檢測方法的成熟和研究的深入，血清miRNA會在冠心病的預(yù)測、診斷、預(yù)后評估、個體化治療等方面擁有廣闊的應(yīng)用前景。

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2013-12-30）

（本文編輯：馬雯娜）

浙江省自然科學(xué)基金（LY13H020009）；寧波市重大擇優(yōu)委托科技攻關(guān)項目（2011C51001）

315000 寧波大學(xué)附屬李惠利醫(yī)院心血管內(nèi)科

周建慶，E-mail：hjmpin@163.com