劉 丹，王 會，胡長平

(中南大學藥學院藥理學系，湖南 長沙 410078)

自噬(autophagy)是存在于真核細胞中的一種進化保守性、溶酶體依賴性的亞細胞降解途徑[1]。在正常生理條件下，自噬發(fā)生在基礎水平，可以在細胞處于饑餓等應激條件下被激活，通過降解長壽蛋白或細胞器為細胞提供物質能量，促進細胞存活。同時自噬的過度激活會導致細胞功能受損和自噬性死亡[2]。自噬的激活包括三個過程，即雙層膜結構自噬小體的形成，自噬小體與溶酶體融合及對內(nèi)容物的呈遞，以及內(nèi)容物的降解。由此產(chǎn)生的脂肪酸、氨基酸等前體分子可再次被細胞利用合成，維持細胞正常的新陳代謝[3]。

人類疾病存在復雜性，在不同的疾病模型中，自噬可能發(fā)揮著保護或有害作用，目前自噬多被認為是細胞內(nèi)一種非特異性的維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)的過程[4]。自噬與慢性阻塞性肺病、肺動脈高壓、急性肺損傷、呼吸道感染和膿毒癥、肺癌等多種肺部疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關[5]。

1 自噬的分子調控機制

自噬是一個進化保守性、溶酶體依賴性的亞細胞降解途徑，根據(jù)底物進入溶酶體途徑的不同可將自噬分為三類：大自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侶介導的自噬(chaperon-mediated autophagy，CMA)[6]。通常所說的自噬一般是指大自噬，大自噬是目前為止研究得最多最深入的一類自噬，其激活時形成的自噬小體(autophagosome)可用熒光或電子顯微鏡觀測。二十世紀90年代對酵母的遺傳研究確認了一系列自噬相關基因(autophagy associated gene，ATG)[7]。Beclin1(即Atg6)與Class Ⅲ PI3K等大分子結合形成復合物，調控自噬小體的成核作用。微管相關蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3B，LC3B)即Atg8是常被當做監(jiān)測大自噬發(fā)生的特異性標志蛋白[8]。LC3B被合成后羧基端的片段會馬上被剪切形成胞漿可溶性的LC3B Ⅰ，當自噬被激活時LC3B Ⅰ被修飾形成膜結合形式的LC3B Ⅱ，LC3B Ⅱ被募集定位到自噬體的雙層膜上，所以LC3B Ⅱ的含量與自噬小體的數(shù)量成正比。當自噬體和溶酶體融合后，LC3B Ⅱ即被溶酶體的水解酶降解。用Western blot檢測LC3B Ⅰ向LC3B Ⅱ轉化是目前比較公認的確定自噬被激活的可信方法，然而，這一方法的局限性在于雖然LC3B Ⅱ的表達量可以反映自噬體的數(shù)量，但在特定時間點檢測到的LC3B Ⅱ并不一定是自噬激活的真實反映。LC3B Ⅱ表達的增加可能是由于自噬激活，也可能是自噬小體降解受阻所致，為了分辨上述兩種可能，在研究中需要引入自噬流(autophagy flux)的概念用以檢測自噬的動態(tài)通量[9]。在微自噬中，溶酶體膜向內(nèi)凹陷，主動攝取胞質內(nèi)容物，而在分子伴侶介導的自噬中，一些分子伴侶如Hsc70、LAMP-2A等可幫助一些未折疊的蛋白進入溶酶體。

目前關于自噬信號傳遞的通路比較公認的主要有：(1)哺乳動物類雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號途徑，雷帕霉素通過抑制mTOR的活性，誘導自噬發(fā)生[10]。mTOR是PI3K相關的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要調控能量代謝、轉錄起始、細胞骨架組裝等與細胞生長、增殖有關的功能。新近研究發(fā)現(xiàn)mTOR信號通路參與調控自噬，生長因子、胰島素等激活mTOR信號通路可抑制自噬。mTOR以結構和功能截然不同的兩種蛋白復合物形式存在，即mTORC1和mTORC2。mTORC1 位于PI3K/Akt信號通路下游，在營養(yǎng)充足或促有絲分裂刺激下被激活。目前，mTORC1調控自噬的具體機制和作用靶點尚不清楚，一般認為mTORC1通過兩條途徑發(fā)揮作用。其一，mTORC1通過抑制Atg1和Atg13的相互作用調控自噬。Atg1/Atg13復合體的形成可激活Atg1，誘導自噬的形成。當細胞處于營養(yǎng)不足狀態(tài)或用雷帕霉素處理時，mTORC1活性受到抑制，此時Atg13迅速去磷酸化，并顯現(xiàn)出對Atg1高度的親和性。其二，mTORC1通過磷酸化ULK1蛋白抑制其活性。在細胞饑餓或雷帕霉素處理條件下，mTORC1活性受到抑制，導致ULK1的去磷酸化和活化，進而誘導自噬的發(fā)生[11]。(2)腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)信號途徑。AMPK主要通過兩條途徑對mTOR起抑制作用。能量缺乏時激活的AMPK直接在T1227和S1345位點活化TSC2，增強其功能，導致TSC1/TSC2下游靶點mTOR1被抑制。或者AMPK通過直接磷酸化mTOR的結合伴侶Raptor抑制后者和mTORC1的活性[12]。此外，AMPK還可以直接與ULK1結合并使其磷酸化調控自噬。ULK1在饑餓狀態(tài)下調控ATG9定位，提高自噬效率[13]。(3)Bcl-2家族蛋白信號途徑。Bcl-2家族蛋白最初被定義為細胞存亡的重要調控因子，最近有報道指出Bcl-2家族也參與自噬的調節(jié)[14-15]。其中抗凋亡的Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-wl和Mcl-1抑制自噬；相反，促凋亡的Bad、Bik、Noxa等則誘導自噬。Bcl-2家族蛋白主要通過Beclin 1發(fā)揮對自噬的調控作用?？沟蛲龅鞍兹鏐cl-2可以通過BH3受體域作用從而抑制Beclin1依賴的自噬。營養(yǎng)不足時，Bcl-2與Beclin1的相互作用受到抑制，導致游離Beclin1增多，自噬激活[16]。(4)腫瘤抑制蛋白p53信號途徑。p53是一種可以使癌細胞滅活或突變的的轉錄調控因子。離體和在體實驗證明，p53主要來自胞質，其失活可以誘導自噬[17]；另外，很多自噬誘導劑可以速進蛋白酶降解p53，而p53的降解又可以抑制自噬的激活。相反，核內(nèi)p53以轉錄調控的形式，通過促進自噬誘導基因如DRAM的表達誘導自噬[18]。此外，p53還可以通過抑制mTOR激活自噬，p53的靶基因sestrin1和sestrin2已經(jīng)被證實是p53活化和mTOR抑制的中間橋梁。因此p53對自噬的調控是雙向的，其具體方向取決于p53在細胞內(nèi)的定位。

2 自噬與肺部疾病

2.1 自噬與慢性阻塞性肺病

慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)以不完全氣流受限為特征，伴有氣管、肺實質和肺血管病變，其組織破壞包括肺氣腫、支氣管炎和肺纖維化[19]。COPD患者肺部可觀察到自噬小體數(shù)量增加和LC3B Ⅱ表達升高，同時其他自噬相關蛋白Atg4、Atg5-Atg12復合物和Atg7也相應表達上調[20]。COPD患者肺部自噬小體的聚集可能是自噬流受損的結果[20]。在LC3B基因敲除小鼠，肺氣腫導致的氣道擴張程度與野生型小鼠相比明顯降低[21]。在COPD中，自噬究竟是直接促進了肺泡上皮細胞的死亡還是有其他通路參與，尚不清楚。吸煙是導致COPD最公認的危險因素。研究表明，自噬蛋白在吸煙誘導的肺氣腫中具有重要作用[20]；LC3B和Beclin 1是調控自噬過程的兩個重要蛋白，將兩者基因沉默后可抑制香煙煙霧提取物誘導的肺泡上皮細胞死亡[22]；香煙煙霧處理的巨噬細胞中自噬過程受損，這種損傷也存在于吸煙者的肺泡巨噬細胞中，并被認為導致了吸煙者的復發(fā)性感染，香煙煙霧處理會阻礙細菌向溶酶體的遞送[22]。

研究證明，mTOR信號通路也與香煙煙霧誘導的COPD和肺氣腫有關。RTP 801是一種DNA損傷應答基因，在香煙煙霧處理后表達上調，并被證實會穩(wěn)定mTOR通路抑制復合物TSC1-TSC2，導致氧化應激誘導的內(nèi)皮細胞和肺泡上皮細胞死亡加劇。RTP801可以解離TSC2抑制蛋白14-3-3，使得TSC1-TSC-2復合物阻斷mTOR活性，進而影響自噬活力[23]。mTOR抑制劑雷帕霉素可以降低肺泡炎癥反應，對暴露于香煙煙霧中的野生型小鼠有保護作用[23]。相反地，雷帕霉素可以增加對照組小鼠肺泡上皮細胞凋亡和炎性細胞數(shù)目，并且減弱RTP801敲除對香煙煙霧暴露組小鼠的保護作用[23]。這些研究說明時間點和靶細胞的不同可能會決定抑制mTOR在疾病進程中是有利還是有害因素。

到目前為止，關于自噬在COPD中作用的研究主要集中在經(jīng)典的非選擇性自噬。有研究表明，選擇性自噬如線粒體自噬，也可能在COPD中發(fā)揮著重要的作用[24]。治療COPD的藥物應當可以平衡自噬的清除和流通，避免自噬小體的過度累積，或者是能夠影響mTOR信號通路。此外，近期研制出的化學伴侶也可被用作治療藥物，在COPD導致的氧化應激條件下，仍然保持蛋白的正常功能[25]。而進一步了解自噬蛋白的細胞保護和促凋亡作用的關系，還需要在COPD病程中對自噬過程進行干擾。

2.2 自噬與肺動脈高壓

肺動脈高壓是指靜息狀態(tài)下肺動脈壓持續(xù)高于25 mmHg或者運動狀態(tài)下高于30 mmHg，平均肺毛細血管楔壓和左心室舒張末壓低于15 mmHg。低氧可以導致繼發(fā)性肺動脈高壓，低氧誘導的肺動脈高壓通常是慢性肺部疾病進展型的致死性并發(fā)癥[26]。研究表明，在肺動脈高壓患者肺部自噬水平升高。小鼠低氧肺動脈高壓時肺組織中自噬體數(shù)量增多，LC3B表達上調；與野生型小鼠相比，LC3B-/-小鼠的肺動脈高壓易感性增加；在LC3B基因沉默的人肺動脈內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞，低氧誘導的細胞增殖被增強[27]。這些結果都說明自噬蛋白LC3B在肺動脈高壓病程中可能起著保護性作用。

另一方面，已有研究報道在肺發(fā)育過程中，自噬與血管新生受損有關[28]。肺動脈高壓胎羊的肺動脈內(nèi)皮細胞血管新生功能受損，但是抑制自噬或者敲除自噬蛋白Beclin 1可以改善血管新生。這說明在肺部發(fā)育過程中，自噬可能導致了肺動脈高壓病程的惡化。從臨床角度來說，選擇合適的時間點介導自噬對于肺動脈高壓的治療具有重要意義。更進一步的研究還需要闡明自噬的功能意義以及自噬是如何在肺動脈高壓發(fā)病機制中發(fā)揮作用的。

2.3 自噬與急性肺損傷

急性肺損傷是一種突發(fā)性的，以雙側肺浸潤和非心臟器官血氧不足為表現(xiàn)的臨床綜合征[29]。急性肺損傷發(fā)病機制復雜，與膿毒癥、高氧、外傷、藥物或異生污染物暴露、機械通氣等有關。臨床上對重癥呼吸衰竭病人進行監(jiān)護時，需要機械通氣給予高濃度氧氣。然而，長期暴露于高氧環(huán)境中可導致肺損傷。LC3B在肺泡上皮細胞中調控高氧誘導的凋亡路徑[30]。高氧誘導自噬小體的形成以及LC3B Ⅰ向LC3B Ⅱ的轉化[30]。siRNA干擾LC3B，高氧暴露后干擾組細胞活力下降[30]。此外，高氧條件下，LC3B還被證實可與Fas死亡誘導信號復合物相關的凋亡途徑相互作用[30]。這些研究都說明LC3B可能潛在地通過干擾或抑制凋亡路徑對高氧條件下的細胞發(fā)揮保護作用。除了LC3B，其他自噬蛋白也可能與Fas依賴的信號通路發(fā)生動態(tài)相互作用，特別是p62、LC3B與Atg3相互作用，使LC3B調控Fas的機制更為復雜[31]。

研究表明，在高氧模型中，低濃度的一氧化碳(CO)可作為一種新型治療干預手段[32]。CO可以上調小鼠肺部以及原代人肺泡細胞和人支氣管上皮細胞中LC3B的表達，運用電鏡手段和綠色熒光蛋白分析顯示上皮細胞中自噬小體形成增多[32]。以上自噬活性的增加可以被抗氧化劑NAC和Mito-TEMPO抑制，說明CO通過活性氧促進自噬；此外，siRNA干擾LC3B后可部分抵消CO對高氧條件下細胞的保護作用，可見LC3B在CO發(fā)揮細胞保護性作用的過程中扮演著重要的角色[32]。這些研究進一步支持了一個概念，即自噬蛋白，如LC3B，可能參與構成維持細胞動態(tài)平衡的信號網(wǎng)絡，決定細胞在應激狀態(tài)下的命運。因此，自噬蛋白可能被視作一個潛在的治療靶點，調控高氧誘導的急性肺損傷，在此之前還需要對急性肺損傷的病理機制和自噬調控的具體過程有更深刻的認識[33]。

2.4 自噬與呼吸道感染及膿毒癥

前面已經(jīng)提到，在香煙煙霧處理的肺泡巨噬細胞和COPD患者肺部，微生物和異生污染物的清除功能受損[34]。自噬與肺部在對細菌、病毒和原蟲感染應答過程有密切聯(lián)系[7]。自噬在呼吸系統(tǒng)結核分枝桿菌感染中的作用研究得已比較明確。免疫相關GTP 酶(immunity-related GTPase M，IRGM)基因的多態(tài)性與結核分枝桿菌易感性升高有關，而IRGM被證實可以誘導自噬清除細胞內(nèi)的結核分枝桿菌[35]?？梢哉{控結核分枝桿菌存活的宿主基因全基因組分析顯示一系列的基因參與調控了自噬，Atg7基因突變的果蠅感染海洋結核分枝桿菌后，使用抗結核分枝桿菌治療無效，存活率明顯下降。而使用抗結核藥異煙肼激活自噬后可以抑制結核分枝桿菌在巨噬細胞中誘導的促炎癥反應[36]。大量涉及到增強自噬活性的療法被證實可有效抗結核分枝桿菌感染?？乖鷦游锼幭踹蚰崽丶捌浠钚源x產(chǎn)物替唑尼特可以有效促進自噬、抑制mTORC1信號通路和細胞內(nèi)結核分枝桿菌的增殖[37]，另外，維生素D被證實可以激活自噬，對HIV和結核分枝桿菌感染患者有治療效果[38]。有意思的是，HIV也可以通過操控自噬來提高自身的侵染性，通常被操作的靶點即IRGM基因[39]。

綜上所述，這些研究都強調了宿主自噬功能在抗結核分枝桿菌中的重要性。已經(jīng)有研究報道印度出現(xiàn)完全抗藥性結核病的原因，并引起完全抗藥性結核菌將在全世界流行的擔憂[40]。為了對抗耐藥性發(fā)展，需要與傳統(tǒng)抗結核藥作用機制不同的新型治療藥物。盡管一些促進自噬的藥物可以作為一種輔助治療手段來增強傳統(tǒng)抗結核藥的療效，但是這些藥物中有些具有免疫抑制等不良反應，如雷帕霉素。其他副作用較小的藥物，如二甲雙胍或卡馬西平可能有更好的療效[40-41]。

最后，自噬被認為與炎癥的調控有關，尤其是與炎性體通路有關。最近一項研究發(fā)現(xiàn)[42]，在核苷酸寡聚化域樣受體3(NALP-3)依賴的炎癥反應中，自噬能保持線粒體的完整性，并將產(chǎn)生活性氧的有害線粒體與炎性體復合物隔離開，抑制炎癥反應[43]。內(nèi)毒素血癥和盲腸結扎穿刺小鼠是常用的兩種研究膿毒癥的模型。LC3B敲除的小鼠與對照組相比，對脂多糖或盲腸結扎穿刺所致膿毒癥更具易感性；LC3B-/-膿毒癥小鼠與野生型膿毒癥小鼠相比，血清中IL-1β和IL-18明顯升高[43]。這些結果說明自噬可在膿毒癥中調控與該病相關的細胞因子釋放，提示宿主自噬在細胞因子對感染的應答過程中起著重要作用。在體增強自噬的藥物可能對膿毒癥有治療效果，在阻塞性黃疸小鼠模型中，海帕西啶可通過自噬對抗脂多糖誘導的肝損傷[44]。低濃度的CO因其能激活自噬可有效阻止脂多糖對各器官造成的損傷，ES-62是一種由線蟲分泌的免疫調制劑，對內(nèi)毒素休克和多種微生物感染性休克小鼠有保護作用，其機制為激活Toll樣受體4介導的自噬[45-46]?？紤]到目前感染性休克治療的局限性，與自噬機制相關的治療方法可能為攻克這一威脅生命的頑疾奠定基礎。

2.5 自噬與肺癌

在多種人類腫瘤中存在有自噬活性的改變，腫瘤的增殖、凋亡信號途徑與自噬信號途徑相互交錯影響，自噬與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。Beclin1 是與Bcl-2 相互影響的蛋白質，且在許多人類癌癥中(包括乳腺、卵巢和前列腺癌)等位基因頻繁缺失[47]。Beclin1 為一種抑癌基因，Beclin1+/-小鼠呈現(xiàn)出原發(fā)性惡性腫瘤高發(fā)狀態(tài)，包括淋巴瘤、肝癌及肺癌[48]。對術后的115 名非小細胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)患者研究發(fā)現(xiàn)，存在著大量核樣結構(stone-like structures，SLS)，表明自噬過度，這與NSCLC 較低存活率可能密切相關[49]。Atg5 和Beclin-1 的敲除，使輻射狀態(tài)下H460 肺癌細胞的存活率增加[50]。自噬可在肺癌細胞中被表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine-kinase inhibitor，TKIs)激活，抑制自噬增強了EGFR-TKIs 的生長抑制作用[51]。另有報道，腫瘤抑制蛋白101F6 和抗壞血酸鹽經(jīng)過不依賴caspase 的凋亡和自噬途徑，能協(xié)同抑制非小細胞肺癌的生長[52]。綜上提示，自噬與肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關，調節(jié)自噬可能是肺癌治療的新靶點。

3 結論與展望

綜上所述，自噬在肺部疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著復雜的作用，當被適時激活時，自噬可以促進細胞的存活，清除有害的蛋白聚合體、細菌和病毒，轉移受損的細胞器，如線粒體。反之，如果自噬小體的流通或者自噬流受損，自噬就會對細胞有害，裝載有蛋白質或感染物的自噬小體在細胞內(nèi)聚集，會促進細胞死亡途徑，但是自噬直接促進細胞凋亡性死亡的具體機制目前還不十分明確。闡明自噬小體形成及自噬促進細胞碎片或有害蛋白質、細胞器清除的機制不僅對多種不同的肺部疾病的治療具有重要意義，還可能對一系列人類其他疾病的治療產(chǎn)生深遠影響。未來對肺部的其他自噬通路的進一步研究，如選擇性自噬、分子伴侶介導的自噬、微自噬等將為新的治療手段的開發(fā)提供新的靶點和思路。

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