吳春園 王俊 高錦飚

高效液相色譜法測(cè)定仙靈骨葆膠囊中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量

吳春園 王俊 高錦飚

目的 采用高效液相色譜法測(cè)定仙靈骨葆膠囊中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量。方法 依利特Hypersil C18色譜柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm)；流速：1.1 ml/min；乙腈-0.05%磷酸(30：70)為流動(dòng)相,檢測(cè)波長(zhǎng)：212 nm。結(jié)果 川續(xù)斷皂苷Ⅵ質(zhì)量濃度在4.36~87.20 μg/ml(r=0.9997)時(shí)與峰面積呈良好的線性關(guān)系, 平均加樣回收率為98.37%, RSD(n=6)為1.25%。結(jié)論 該方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性好。

仙靈骨葆膠囊；川續(xù)斷皂苷Ⅵ；高效液相色譜法

仙靈骨葆膠囊為中藥復(fù)方制劑, 處方源于國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編骨傷科分冊(cè), 由續(xù)斷、淫羊藿、丹參、知母、補(bǔ)骨脂、地黃等6味藥物組成［1］, 具有滋補(bǔ)肝腎, 活血通絡(luò), 強(qiáng)筋壯骨的功效, 可用于肝腎不足、瘀血阻絡(luò)所致骨質(zhì)疏松癥的治療［2］。本文采用HPLC法對(duì)續(xù)斷中川續(xù)斷皂苷Ⅵ進(jìn)行含量測(cè)定方法學(xué)研究, 為今后完善該品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料與方法

1.1試藥與儀器 LC-10ATVP型高效液相色譜儀(型號(hào)：日本島津)；ANASTAR色譜數(shù)據(jù)工作站；紫外可見檢測(cè)器(型號(hào)：SPD-1OAVP)；川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品(批號(hào)：111685-201305)來源于中國(guó)食品藥品檢定研究院；仙靈骨葆膠囊(市售；規(guī)格為每粒裝0.5 g；批號(hào)分別為140302、140303、140307)；磷酸為分析純, 購(gòu)于廣州化學(xué)試劑二廠；乙腈為色譜純, 購(gòu)于天津市康科德科技有限公司。

1.2色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性 C18色譜柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm)；采用乙腈-0.05%磷酸(30：70)為檢測(cè)流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為212 nm；流速為1.1 ml/min。在上述色譜條件下川續(xù)斷皂苷Ⅵ與其他組分的分離效果良好, 以川續(xù)斷皂苷Ⅵ計(jì)理論塔板數(shù)應(yīng)不低于3500, 分離度不低于1.5。

1.3檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 稱取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品適量, 置50 ml量瓶中, 加入流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度, 制得0.10 mg/ml［3,4］的川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品溶液, 按照中國(guó)藥典附錄中紫外-可見分光光度法檢測(cè)方法檢測(cè)［3,4］, 檢測(cè)波長(zhǎng)定為200~400 nm,掃描結(jié)果顯示川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品在212 nm的波長(zhǎng)處有最大吸收, 因此將川續(xù)斷皂苷Ⅵ的檢測(cè)波長(zhǎng)定為212 nm。

1.4對(duì)照品溶液的制備 精密稱取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品適量, 置20 ml具塞容量瓶中, 加65%甲醇溶解并稀釋至刻度,制成0.4360 mg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密吸取上述對(duì)照品儲(chǔ)備溶液5 ml, 置50 ml具塞容量瓶中, 加65%甲醇稀釋至刻度, 搖勻, 即得0.0436 mg/ml的對(duì)照品溶液。

1.5供試品溶液的配制 取仙靈骨葆膠囊數(shù)粒, 傾出內(nèi)容物, 除去膠囊殼, 研細(xì), 取約0.5 g, 精密稱定, 置100 ml容量瓶中, 加65%甲醇至刻度, 超聲波(100W, 40 kHz)超聲處理30 min, 采用65%甲醇補(bǔ)充減失的重量, 振搖, 采用微孔濾膜進(jìn)行過濾, 所得濾液作為供試品溶液。

1.6陰性對(duì)照溶液的配制 按仙靈骨葆膠囊處方比例稱取除續(xù)斷外的其余藥材, 按照仙靈骨葆膠囊的生產(chǎn)工藝制成續(xù)斷空白樣品, 按照“1.5”項(xiàng)下的供試品溶液的制備方法制成續(xù)斷空白對(duì)照溶液。

2 結(jié)果

2.1陰性對(duì)照試驗(yàn) 分別精密吸取10 ul的供試品溶液、對(duì)照品溶液及空白對(duì)照溶液, 按“1.2”項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行檢驗(yàn),檢驗(yàn)結(jié)果顯示：供試品溶液的色譜圖中, 在與川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品相同保留時(shí)間處有吸收峰, 而空白對(duì)照溶液在該組分保留時(shí)間處未顯示吸收峰。

2.2線性關(guān)系考察 分別精密吸取“1.4”項(xiàng)下川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 ml, 分別置于5個(gè) 10 ml的容量瓶中, 加65%甲醇稀釋至刻度, 搖勻。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定, 以峰面積Y與對(duì)照品質(zhì)量濃度X, 得川續(xù)斷皂苷Ⅵ回歸方程為： Y=2.0648×104X+326.9, r=0.999 7, 線性范圍為4.36~87.20 μg/ml。結(jié)果表明：川續(xù)斷皂苷Ⅵ在其線性范圍內(nèi), 所測(cè)組分質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3精密度實(shí)驗(yàn)研究 取“1.4”項(xiàng)下的川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品溶液按照“1.2”項(xiàng)下色譜條件, 重復(fù)進(jìn)行6次進(jìn)樣, 分別記錄續(xù)斷皂苷Ⅵ的峰面積, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 該儀器具有良好的精密度, 川續(xù)斷皂苷Ⅵ的RSD為0.72%, 符合規(guī)定要求。

2.4重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)研究 稱取同一批號(hào)供試品, 按”1.5”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液, 按照“1.2”項(xiàng)下色譜條件依法進(jìn)樣測(cè)定, 川續(xù)斷皂苷Ⅵ的RSD為0.45%。本法測(cè)定重現(xiàn)性良好。

2.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)研究 取同一批號(hào)產(chǎn)品的同一供試品溶液,分別在放置0、2、4、6、12、24 h后精密吸取10 μl進(jìn)樣,測(cè)定其峰面積值, 川續(xù)斷皂苷Ⅵ的RSD為0.81%, 供試品溶液在放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6加樣回收率試驗(yàn) 取川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量為8.26 mg/g的同一批樣品適量, 傾出內(nèi)容物, 研細(xì), 取約0.25 g, 精密稱定, 置100 ml容量瓶中, 加對(duì)照品溶液25 ml、65%甲醇25 ml, 超聲波(100 W, 40 kHz)超聲處理30 min, 采用65%甲醇補(bǔ)充減失的重量, 振搖, 采用微孔濾膜進(jìn)行過濾, 所得濾液作為加樣供試品溶液［5-8］。按上述含量測(cè)定方法測(cè)定其峰面積, 計(jì)算回收率, 川續(xù)斷皂苷Ⅵ平均加樣回收率為98.37%, RSD(n=6)為1.25%。結(jié)果表明本方法回收率良好。

2.7樣品測(cè)定 取3批樣品測(cè)定川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量, 川續(xù)斷皂苷Ⅵ分別為4.13、4.27、3.98 mg/片。

3 討論

流動(dòng)相選擇時(shí)分別以乙腈一水(30:70)、甲醇一水(30:70)和乙腈-0.05%磷酸(30：70)為流動(dòng)相, 結(jié)果甲醇一水(30:70)分離效果不好, 未達(dá)到基線分離；乙腈一水(30:70)川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰形不對(duì)稱, 拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重；而乙腈-0.05%磷酸(30:70)能達(dá)到基線分離, 峰形較好。故選用乙腈-0.05%磷酸(30:70)為流動(dòng)相。

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部).北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2010:309-310, 附錄30, 附錄36.

［2］ 彭鍵.高效液相色譜法測(cè)定跌打丸中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量.中南藥學(xué), 2012, 10(01):25-28.

［3］ 樊媛潔, 翟永松, 王滿元.不同炮制方法對(duì)續(xù)斷飲片中川續(xù)斷皂苷Ⅵ、X含量的影響.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2013, 19(17): 22-24.

［4］ 盧鳳來, 蔣海英, 陳月圓, 等.HPLC-ELSD法測(cè)定山銀花中綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙.中成藥, 2013, 35(08):1821-1823.

［5］ 楊潔芳.LC-MS法同時(shí)測(cè)定骨康膠囊中6種主要成分的含量.中國(guó)藥房, 2012, 23(35):3344-3346.

［6］ 付敏, 楊全偉, 韓建偉.HPLC法測(cè)定活絡(luò)鎮(zhèn)痛膏貼中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量.中國(guó)藥師, 2013, 16(11):1748-1749.

［7］ 楊武德, 彭嬌平, 馮靜.高效液相色譜法測(cè)定黔不同產(chǎn)地的續(xù)斷中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2011(17):1469-1471.

［8］ 谷丹丹, 鄧洪, 覃瑤, 等.正交設(shè)計(jì)優(yōu)化川續(xù)斷中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的提取工藝.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2013, 24(07):1587-1588.

2014-05-20］

213022 常州市新北區(qū)三井人民醫(yī)院(吳春園)；金壇市人民醫(yī)院(王俊)；南京中醫(yī)藥大學(xué)(高錦飚)