王媛媛 曹 建 鄧 莉 陳 勤 歐陽先國.南昌市第三醫(yī)院心內科，南昌 330009；2.南昌大學第二附屬醫(yī)院麻醉科，南昌 330006

依達拉奉聯(lián)合烏司他丁對大鼠缺血/再灌注心肌細胞凋亡的影響

王媛媛1曹 建2▲鄧 莉1陳 勤1歐陽先國1
1.南昌市第三醫(yī)院心內科，南昌 330009；2.南昌大學第二附屬醫(yī)院麻醉科，南昌 330006

目的 研究依達拉奉聯(lián)合烏司他丁對大鼠缺血/再灌注心肌細胞凋亡的影響。 方法 將50只實驗動物隨機分為假手術組、缺血/再灌注組、缺血/再灌注+依達拉奉組、缺血/再灌注+烏司他丁組、缺血/再灌注+依達拉奉+烏司他丁組，采用墊扎球囊法結扎冠狀動脈制作大鼠心肌缺血/再灌注模型。測定心肌組織谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）的含量，采用TUNEL法進行細胞凋亡檢測，用Western-blot方法測定凋亡因子Caspase-3、Caspase-9的表達。 結果 與假手術組比較，缺血/再灌注組的GSH明顯減少 （P<0.01），MDA及心肌凋亡指數(shù)明顯升高（P<0.05），Caspase-3、Caspase-9蛋白表達增加（P<0.01）；與缺血/再灌注組比較，各藥物組的 GSH 活性顯著增加（P<0.05），MDA 含量及心肌凋亡指數(shù)明顯減少（P<0.05），Caspase-3、Caspase-9 蛋白表達降低（P<0.05），聯(lián)合藥物治療組優(yōu)于單獨藥物治療組（P<0.01）。 結論 依達拉奉聯(lián)合烏司他丁具有抗心肌缺血/再灌注損傷作用，其機制可能是通過調節(jié)Caspase-3和Caspase-9介導的細胞凋亡而實現(xiàn)。

心肌缺血/再灌注損傷；細胞凋亡；依達拉奉；烏司他丁

心肌缺血/再灌注損傷（myocardial ischemia/reperfusion injury，MIRI）指短時間心肌血供中斷，一定時間內恢復血供，原缺血心肌發(fā)生較血供恢復前更嚴重的損傷。研究表明氧自由基、鈣超載、心肌纖維能量代謝障礙、血管內皮細胞、細胞凋亡等因素均可能參與MIRI的發(fā)病過程[1-3]。本研究在冠狀動脈再灌注前給予注射依達拉奉、烏司他丁、依達拉奉聯(lián)合烏司他丁進行藥物后處理，與缺血后處理對照，觀察其對大鼠MIRI的作用效果，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

取10周左右雄性SD大鼠50只，體重（200±20）g，由南昌大學動物實驗中心提供。依達拉奉注射液（南京先聲藥業(yè)有限公司生產，國藥準字20031342）10 mg/支，烏司他?。◤V東天普生化醫(yī)藥股份有限公司生產，批號 03080806）100 000 U/瓶，谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）檢測試劑盒購自武漢亞法生物制品有限公司，Caspase-3、Caspase-9多克隆抗體購自美國Bioworld生物技術公司，堿性磷酸酶（AP）顯色底物，anti-NF-κB，小鼠單抗辣根酶標記兔抗山羊IgG；anti-β-actin山羊單抗（SantaCruz產品）。

1.2 模型制作及分組

將實驗動物50只隨機分為5組，假手術組（n=10），絲線穿過冠狀動脈左室支但不結扎，經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水。其余4組參考趙秀梅等[4]的墊扎球囊法制作大鼠體心肌缺血/再灌注模型。將充盈的球囊（215 mm×10 mm）墊于冠狀動脈前降支與結扎線之間，用力結扎，觀察結扎區(qū)域變白，局部心肌運動減弱，兩個以上導聯(lián)上出現(xiàn)ST段明顯上抬，提示結扎成功，45 min后將球囊快速抽空便可即刻實現(xiàn)前降支血流再灌注（以心電圖相關導聯(lián)ST段明顯回落為標準），并持續(xù)再灌注3 h。缺血/再灌注組（n=10），結扎冠狀動脈后5 min分別通過尾靜脈接受靜脈注射生理鹽水，45 min后放松扎線使冠狀動脈再通形成再灌注3 h至實驗結束；缺血/再灌注+依達拉奉組（n=10），結扎冠狀動脈后5 min通過尾靜脈接受靜脈注射依達拉奉1.5 ml/（kg·h），其余同缺血/再灌注組；缺血/再灌注+烏司他丁組（n=10），結扎左冠狀動脈左室支前30 min靜脈注射烏司他丁（50 000 U/kg），其余同缺血/再灌注組；缺血/再灌注+依達拉奉+烏司他丁組（n=10），結扎左冠狀動脈左室支前30 min靜脈注射烏司他丁（50 000 U/kg），結扎冠狀動脈后5 min通過尾靜脈接受靜脈注射依達拉奉 1.5 ml/（kg·h），其余同缺血/再灌注組。 實驗結束后取大鼠左心室游離壁心肌組織迅速置液氮中冷卻并于-80℃凍存。

1.3 GSH、MDA含量測定

實驗結束后即刻分別取缺血區(qū)及正常供血區(qū)左心室心肌組織1.0 g，低溫狀態(tài)下生理鹽水沖洗干凈，制成心肌勻漿液，離心后取上清液，按GSH、MDA試劑盒說明書操作，檢測GSH、MDA的含量。

1.4 細胞凋亡的檢測（TUNEL法）

心臟標本用中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，制片，切片按試劑盒進行細胞凋亡檢測。凋亡指數(shù)為計數(shù)1000個心肌細胞中染色陽性的凋亡細胞。

1.5 Western-blot法檢測Caspase-3、Caspase-9蛋白水平

分別取5組心肌組織，提取總蛋白，收集上清液，考馬斯亮藍法進行蛋白定量。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離樣品后電泳轉移至硝酸纖維膜上，TBST常溫下封閉過夜后，分別加入anti-NF-κB小鼠單抗（一抗）、室溫下免疫沉淀1 h，加入辣根酶標記兔抗山羊IgG（二抗）2 h。洗膜，顯色。用Gel-Pro-Analyzer分析軟件分析通道蛋白的灰度值。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料用±s表示，多組間比較應用單因素方差分析，組間兩兩比較應用q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各實驗組GSH、MDA水平的比較

與假手術組比較，缺血/再灌注組的GSH含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與缺血/再灌注組比較，缺血/再灌注+依達拉奉組、缺血/再灌注+烏司他丁組的GSH含量顯著增加（P<0.05），缺血/再灌注+依達拉奉+烏司他丁組的GSH含量優(yōu)于缺血/再灌注+依達拉奉組、缺血/再灌注+烏司他丁組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與假手術組比較，缺血/再灌注組的MDA含量明顯增加（P<0.01）；與缺血/再灌注組比較，缺血/再灌注+依達拉奉組、缺血/再灌注+烏司他丁組的 MDA含量顯著減少（P<0.05），缺血/再灌注+依達拉奉+烏司他丁組的MDA含量優(yōu)于缺血/再灌注+依達拉奉組、缺血/再灌注+烏司他丁組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）（表 1）。

表1 各實驗組GSH、MDA水平的比較（±s，n=10）

表1 各實驗組GSH、MDA水平的比較（±s，n=10）

與假手術組比較，*P<0.01；與缺血/再灌注組比較，#P<0.05；與缺血/再灌注+依達拉奉組、缺血/再灌注+烏司他丁組比較，△P<0.01

組別 GSH（mg/L） MDA（nmol/L）假手術組缺血/再灌注組缺血/再灌注+依達拉奉組缺血/再灌注+烏司他丁組缺血/再灌注+依達拉奉+烏司他丁組241.42±3.28 180.26±2.14*200.14±3.16#197.27±4.38#221.57±3.52△4.13±3.27 10.13±2.13*8.42±5.16#8.15±4.26#7.24±1.18△

2.2 缺血/再灌注心肌凋亡細胞TUNEL法染色結果

凋亡的細胞核呈現(xiàn)為黃色、棕黃色或棕褐色，主要是心肌細胞，少數(shù)為浸潤的淋巴細胞和血管內皮細胞。假手術組僅見極少數(shù)散在的凋亡細胞；缺血/再灌注組凋亡細胞明顯增加，凋亡細胞多位于心肌梗死區(qū)與非梗死區(qū)交界處，它主要來自于心肌細胞；缺血/再灌注+依達拉奉組、缺血/再灌注+烏司他丁組及缺血/再灌注+依達拉奉+烏司他丁組與缺血/再灌注組比較，凋亡細胞明顯減少。與假手術組比較，缺血/再灌注組心肌凋亡指數(shù)明顯增加（P<0.01）；與缺血/再灌注組比較，缺血/再灌注+依達拉奉組、缺血/再灌注+烏司他丁組心肌凋亡指數(shù)明顯降低（P<0.05），缺血再灌注+依達拉奉+烏司他丁組優(yōu)于缺血/再灌注+依達拉奉組、缺血/再灌注+烏司他丁組（P<0.01）（表 2）。

表2 各實驗組心肌細胞凋亡指數(shù)的比較（±s，n=10）

表2 各實驗組心肌細胞凋亡指數(shù)的比較（±s，n=10）

與假手術組比較，*P<0.01；與缺血/再灌注組比較，#P<0.05；與缺血/再灌注+依達拉奉組、缺血/再灌注+烏司他丁組比較，△P<0.01

組別 心肌細胞凋亡指數(shù)假手術組缺血/再灌注組缺血/再灌注+依達拉奉組缺血/再灌注+烏司他丁組缺血/再灌注+依達拉奉+烏司他丁組4.62±1.24 12.24±0.81*6.87±1.14#7.14±0.52#5.26±0.78△

2.3 各實驗組Caspase-3、Caspase-9蛋白表達水平的比較

采用 Western-blot法檢測 Caspase-3、Caspase-9蛋白水平，用Gel-ProAnalyzer分析軟件分析通道蛋白的灰度值。與假手術組比較，缺血/再灌注組Caspase-3、Caspase-9蛋白增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與缺血/再灌注組比較，缺血/再灌注+依達拉奉組、缺血/再灌注+烏司他丁組心肌Caspase-3、Caspase-9蛋白明顯降低（P<0.05）；缺血/再灌注+依達拉奉+烏司他丁組優(yōu)于缺血/再灌注+依達拉奉組、缺血/再灌注+烏司他丁組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）（表3）。

表3 各實驗組Caspase-3、Caspase-9蛋白表達水平的比較（±s，10）

表3 各實驗組Caspase-3、Caspase-9蛋白表達水平的比較（±s，10）

與假手術組比較，*P<0.01；與缺血/再灌注組，#P<0.05；與缺血/再灌注+依達拉奉組、缺血/再灌注+烏司他丁組比較，△P<0.01

組別 Caspase-3 Caspase-9假手術組缺血/再灌注組缺血/再灌注+依達拉奉組缺血/再灌注+烏司他丁組缺血/再灌注+依達拉奉+烏司他丁組0.142±0.125 1.743±0.318*0.642±0.227#0.713±0.437#0.504±0.329△0.227±0.024 1.272±0.408*0.824±0.346#0.716±0.351#0.624±0.115△

3 討論

MIRI患者心肌再灌注過程中細胞凋亡及氧自由基爆發(fā)性產生是造成再灌注損傷的主要因素之一，也是內皮細胞損傷的主要機制[5-6]。本實驗制作大鼠缺血/再灌注模型，并給予依達拉奉、烏司他丁干預處理，發(fā)現(xiàn)藥物處理后，可以減輕氧化應激、降低心肌細胞凋亡指數(shù)，聯(lián)合治療組優(yōu)于單獨藥物治療組。

心肌缺血/再灌注時隨著大量氧的涌入，致使氧自由基大量產生，使膜電位不穩(wěn)定，觸發(fā)嚴重的心律失常[7-8]。缺血心肌再灌注時產生的大量氧自由基是導致心肌缺血/再灌注的主要因素。缺血/再灌注后由于氧自由基、髓過氧化物酶及彈性蛋白酶的大量產生和許多炎癥介質如激活的補體C5a、白介素、腫瘤壞死因子（TNF）等大量釋放[9-10]，產生炎癥反應，誘導中性粒細胞穿內皮遷移以及對缺血心肌的浸潤及損傷。依達拉奉是自由基最強的清除劑[11]，通過清除自由基起到抑制細胞膜過氧化作用[11-12]。烏司他丁是從健康人尿中提取精制的糖蛋白，研究表明烏司他丁對于降低炎性介質白細胞介素-6和白細胞介素-8有明顯的作用[13]，能減輕炎癥反應。

本實驗發(fā)現(xiàn)依達拉奉、烏司他丁及聯(lián)合干預處理后，心肌細胞凋亡指數(shù)下降，同時凋亡因子Caspase-3、Caspase-9蛋白表達下降。Caspase-3是凋亡發(fā)生過程中所需要的一種重要的蛋白酶，也是介導細胞凋亡的核心蛋白酶。在某些應激損傷因素下，可激活Caspases的啟動子，主要是Caspase-9，Caspase-9接受到凋亡活化信號后通過被酶催化或自剪接而激活然后引起Caspase級聯(lián)反應。Caspase-9在級聯(lián)反應的上游，活化的Caspase-9進一步激活其下游的Caspase-3促使細胞發(fā)生凋亡[14]。通過GSH、MDA的檢測，提示依達拉奉及烏司他丁均具有抗氧化損傷的作用，并且兩藥合用具有協(xié)同作用。凋亡因子Caspase-3、Caspase-9蛋白表達下降，心肌細胞凋亡指數(shù)降低，兩藥均可以通過抗氧化損傷，減少細胞凋亡的途徑，對大鼠缺血/再灌注心肌起到保護作用。聯(lián)合藥物治療組優(yōu)于單獨藥物治療組，合用可以同時發(fā)揮依達拉奉清除氧自由基的能力及烏司他丁改善炎癥反應的作用，更好地改善MIRI，值得進一步研究，并應用于臨床。

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The influence of edaravone combined with ulinastatin on ischemia/reperfusion myocardial cell apoptosis in rats

WANG Yuan-yuan1CAO Jian2▲ DENG Li1CHEN Qin1OUYANG Xian-guo1
1.Department of Cardiology,the Third Hospital of Nanchang City,Nanchang 330009,China;2.Department of Anesthesiology,the Second Affiliated Hospital to Nanchang University,Nanchang 330006,China

ObjectiveTo explore the influence of edaravone combined with ulinastatin on ischemia/reperfusion myocardial cell apoptosis in rats.Methods 50 cases of experimental rats were randomly divided into sham group,ischemia/reperfusion(I/R)group,I/R+edaravon group,I/R+ulinastatin group and I/R+edaravon+ulinastatin group.The experimental model of myocardial ischemia/reperfusion in rats was established by ligating coronary artery with capsule.The content of myocardial tissue glutathione (GSH)and malondialdehyde (MDA)were determined.The cell apoptosis was detected by TUNEL and the expression of apoptosis factors Caspase-3 and Caspase-9 were determined by Western-blot.ResultsCompared with sham group,GSH in I/R group reduced remarkably(P<0.01),MDA and myocardial apoptotic index significantly increased (P<0.05),the expression of Caspase-3 and Caspase-9 enhanced (P<0.01);Compared with the I/R group,GSH in each drug group improved(P<0.05),MDA and myocardial apoptotic index significantly decreased(P<0.05),the expression of Caspase-3 and Caspase-9 decreased(P<0.05),the combined drug treatment group was superior to the single drug treatment group(P<0.01).ConclusionEdaravone combined with ulinastatin has the effect of anti-myocardial ischemia/reperfusion injury.The mechanism may be related to the regulation of apoptosis mediated by Caspase-3 and Caspase-9.

Myocardial ischemia/reperfusion injury;Apoptosis;Edaravone;Ulinastatin

R541

A

1674-4721（2014）04（c）-0018-04

江西省衛(wèi)生廳科技計劃（20142041）▲

2014-03-03 本文編輯：郭靜娟）