楊世銀 蔡雨函

一、狂犬病病毒及其概況

狂犬病病毒(RV)屬彈狀病毒科(Rhabdoviridae) 狂犬病毒屬(Lyssavirus) 典型的血清Ⅰ型病毒。狂犬病病毒基因組由11928～11932個核苷酸組成,為單鏈、不分節(jié)段的負鏈RNA ?；蚪M從5’端至3’端的排列順序為N、M1、M2、G 和L 基因,分別編碼病毒核蛋白(NP)、衣殼基質(zhì)蛋白(M1P)、膜基質(zhì)蛋白(M2P)、糖蛋白(GP)和轉(zhuǎn)錄酶大蛋白(LP)?？袢〔《揪哂袃煞N主要抗原: 一種為病毒外膜上的糖蛋白抗原, 能與乙酰膽堿受體結(jié)合使病毒具有神經(jīng)毒性,并使體內(nèi)產(chǎn)生中和抗體及血凝抑制抗體,中和抗體具有保護作用；另一種為內(nèi)層的核蛋白抗原,可使體內(nèi)產(chǎn)生補體結(jié)合抗體和沉淀素, 無保護作用。其中N 基因高度保守且高效表達,不僅可用于檢測狂犬病毒感染,也可作為分子和抗原性的比較對象而廣泛用于狂犬病病毒的分類研究中。

狂犬病病毒對脂溶劑（肥皂水、氯仿、丙酮等）、乙醇、甲醛、碘制劑以及季胺類化合物、酸（pH4 以下），堿（pH10 以上）敏感，容易被殺滅；對日光、紫外線和熱敏感，病毒懸液經(jīng)56℃30 ～60 分鐘或100℃2 分鐘即失去活力，因此也易被巴氏消毒法消毒；不易被酚或來蘇爾溶液殺滅；對干燥、反復凍融有一定抵抗力。在50%甘油中保存的感染腦組織中至少可存活1個月，4℃數(shù)周，低溫中數(shù)月、甚至幾年，室溫中不穩(wěn)定。反復凍融可使病毒滅活。狂犬病病毒能抵抗自溶與腐爛，在自溶的腦組織中可以保持活力7 ～10 天，凍干條件下可以長期存活。

狂犬病的特征性癥狀是飲水時, 患者會出現(xiàn)吞咽肌痙攣, 不能將水咽下, 隨后患者口極渴卻不敢飲水, 故又名恐水癥。人狂犬病通常由患病動物咬傷,導致動物唾液中狂犬病毒侵入人體后感染所致?？袢∈瞧駷橹共∷缆首罡叩募毙詡魅静? 一旦發(fā)病, 病死率幾乎100%。

二、狂犬病的診斷方法

（一）狂犬病檢測安全要求與采樣

任何有關狂犬病的實驗室工作都具有高危險性,所有RV 可疑污染的物品都應該按照WHO 的要求在安全的條件下妥善處理。所有進行狂犬病診斷以及進行尸體剖檢的工作人員在工作之前,都應進行疫苗免疫接種并確認獲得保護。

狂犬病是一種以侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)為特征的致死性疾病,通常采用腦組織學和病毒學檢查來確診。對于病死的動物和人，腦是病毒學檢測的主要樣本，可以檢測到病毒包涵體?？袢』疾游锛安∪说哪X脊液也是重要的檢測樣本,因為腦脊液含有病毒抗原和循環(huán)抗體。病毒可通過腦脊液在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)擴散,已證實在感染后期人和犬腦脊液中含有中和抗體。動物活檢取腦不太可行,因此皮膚活檢更為實用,是臨床階段人狂犬病有效的早期診斷方法。皮膚活檢最好的部位是頸部,有時在其他部位上皮也能檢測出病毒。應用免疫熒光技術對皮膚活檢具有很高的靈敏性。

（二）臨床診斷

潛伏期10 天至2個月，有時更久，傷口接近腦、傷口深、病毒排量多、毒力強則潛伏期短、發(fā)病快。臨床表現(xiàn)可分為狂躁型和麻痹型兩種。精神沉郁，常躲陰暗處，不愿接近人，當受到光、音響刺激或主人撫摸時突然跳起，喜歡吃泥土、石塊、木片、布塊等異物，喉頭麻痹，唾液增多。興奮期2～4天，狂躁不安，攻擊性強，亂咬人。病犬表現(xiàn)恐水，聽見水聲即呈現(xiàn)癲狂發(fā)作。眼球突出，消瘦，瞳孔散大或縮小，下頜麻痹。麻痹期1～2 天。病犬舌脫出口外，下頜下垂，流涎，后驅(qū)麻痹，走路搖擺，臥地不起，最后呼吸麻痹而死。麻痹性興奮期短，病犬頭部肌肉麻痹，吞咽困難，流涎，恐水，臥地不起等，一般2～4 天死亡。

（三）病理學診斷

病理剖解：病犬體表有外傷或擦傷，口腔和咽喉粘膜充血、出血和糜爛。胃空虛，有石塊、木塊等異物。腦軟膜腫脹、充血和出血，第四腦室有黃色或粉紅色液體。腸道呼吸道急性卡他性炎癥。

組織學診斷：主要為非化膿性腦炎和神經(jīng)炎。大腦海馬角、小腦和延腦的神經(jīng)細胞胞漿內(nèi)有嗜酸性包涵體（內(nèi)基氏小體）。其直徑3～20μm，呈梭形、圓形或橢圓形。

電鏡檢測：用病犬延腦、海馬角、脊液和唾液研磨成懸液，接種PK 細胞，待細胞病變后，3000r/min 離心30min，吸上清制片，電鏡觀察可見子彈狀或桿狀病毒粒子，一端扁平、另一端鈍圓。

（四）乳鼠診斷方法

取1～2日齡乳鼠，向其大腦注射經(jīng)青霉素和鏈霉素處理過的10%的大腦混懸液，注射部位用1%碘酊消毒后，用針頭從額骨處插入針頭注射0.2ml 腦混懸液。接種后5～8 天，乳鼠出現(xiàn)狂犬病臨床癥狀：后肢和食管麻痹，8～9 天死亡。尸檢所見：腸粘膜充血，膀胱充盈，增大5～8 倍。大腦圖片和組織切片可觀察到奈格爾氏小體，準確性可達100%。

（五）血清學診斷

1、直接熒光抗體試驗(DFA)

感染狂犬病病毒的細胞攜帶狂犬病病毒抗原,狂犬病病毒抗原可以特異性與異硫酸熒光素(FITC)標記的抗狂犬病病毒單克隆抗體結(jié)合。FITC 在熒光顯微鏡下顯示可見熒光,使抗原抗體的特異性反應在熒光顯微鏡能直接觀察。此法快速、特異又敏感,為目前診斷狂犬病病毒感染的首選方法,已被世界衛(wèi)生組織(WHO)和我國衛(wèi)生部推薦?？捎糜诳袢』颊吆透腥緞游锏脑\斷,其標本可選受傷處的皮膚組織、后頸帶毛囊的皮膚組織(皮膚切片)和部分體液(唾液、腦脊液等),而角膜(印片)因取樣困難,可靠性低,因此不推薦使用。死后可做腦組織檢查,在細胞內(nèi)病毒特異性熒光為黃綠色顆粒,分布在感染細胞的胞漿內(nèi)。根據(jù)特異性熒光顆粒的多少、熒光亮度、陽性細胞在細胞總數(shù)中所占比例,可將免疫熒光反應分為“+…+”(陽性細胞數(shù)< 25%為“+”，25%～50%為“++”，50%～75%為“+++”，>75%為“++++”) ,無特異性熒光為陰性。陽性結(jié)果表示有狂犬病病毒感染,有確診意義。

2、酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)

根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合特點,用抗狂犬病病毒特異性單克隆抗體包被塑料板,與標本中待檢抗原結(jié)合,其中待檢抗原又與后加入的辣根過氧化物酶標記的抗狂犬病病毒單克隆抗體特異性結(jié)合,通過辣根過氧化物酶與底物作用而發(fā)生顏色反應,其顯色程度與待檢抗原含量呈正相關,檢測到狂犬病病毒抗原陽性有診斷意義。此法又被稱為快速狂犬病毒酶免疫診斷(RREID),由法國Pasteur 研究所首創(chuàng)并被WHO 推薦用于檢測狂犬病病毒抗原。其靈敏度高、特異性強,加之無需昂貴設備,操作簡便,因此便于推廣使用。余光開等建立了ELISA 檢測家 犬唾液中的狂犬病病毒抗原,并研制出檢測狂犬病病毒抗原試劑盒,其方法敏感、特異,已應用到犬只測毒推廣項目中。

（六）分子生物學診斷

目前檢測狂犬病病毒的方法有動物接種、病毒分離和血清學試驗等,這些方法有的費時、費力,有的存在非特異性反應和敏感性低等缺點,因此迫切需要一種快速、敏感、特異的方法來解決這一問題。核酸診斷是最近幾年發(fā)展起來的一種檢測方法,具有敏感、特異、快速的優(yōu)點,有人將其應用于狂犬病病毒的檢測,取得了較好的結(jié)果。

1.RT-PCR 檢測技術

邵西群等建立了狂犬病毒RT-PCR 檢測方法，采用RNA 提取試劑盒，從病犬的腦組織、腦脊液或唾液中提取狂犬病病毒及其疑似病毒。以病毒保守性強的核蛋白（N）在Genbank 查找序列，多序列比對后根據(jù)保守區(qū)段設計了3 條引物，其中FP 引物也作為反轉(zhuǎn)錄引物。引物FP 和RP 位于參 考 序 列ACCESSION NC-001542 的57～78bp 和647～668bp，PCR 產(chǎn)物長度約612bp。引物如下：RAB-FP1：5’GTAACACCCCTACAATGGATGC3’；RABFP2：5’CTGGATCCTCTACAATGGATGC3’；RAB-RP：5’TGTACTCCAGTTRGCACACAT3’。

反應條件及循環(huán)參數(shù)RT 反應：20～25μL 體系，RNA 樣 品5μL，F(xiàn)P 引 物1μM，dNTP0.5m M，AMV 酶5～7U，Ribonuclease Inhibitor 20U；RNA和引物的混合物在70℃作用8min，冰浴10min。再加入反應其他組分，42℃反應50min，90℃作用7min，cDNA 可于-20℃保存?zhèn)溆?。PCR 反應：30μL 體系，cDNA 3μL，F(xiàn)P、R P 引物終濃度各0.3μM，dNTP0.2mM，TaqTM 聚合酶1U；反應循環(huán)參數(shù)：預變性94℃2min；94℃35s，54℃30s，72℃40s，35個循環(huán)；70℃延伸5min。邵西群等通過凝膠電泳技術檢測到擴增的612bp 目標產(chǎn)物，可用于快速檢測。

2.基因芯片診斷

根據(jù)已發(fā)表的狂犬病病毒(RV)的序列，設計合成能擴增高度保守核(N)蛋白片斷的一對引物。通過生物素標記PCR 技術，將核(N)蛋白基因片斷作為探針點在硝酸素纖維膜上，制作成疾病診斷基因芯片。提取可疑動物核酸作模板進行PCR擴增，將其產(chǎn)物與診斷基因芯片進行特異性逆向點雜交檢測。此方法建立的狂犬病診斷基因芯片具有比ELISA 更高的靈敏度和特異性。