范彥雷，婁忠子，李 立，閆鴻斌，賈萬(wàn)忠

絳蟲屬扁形動(dòng)物門絳蟲綱，營(yíng)寄生生活，其成蟲和幼蟲分別寄生于不同宿主，但也有寄生于同一宿主體內(nèi)者(如豬帶絳蟲)。對(duì)人體及動(dòng)物危害較為嚴(yán)重的是絳蟲的幼蟲，蟲卵進(jìn)入中間宿主后經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)適宜部位發(fā)育成囊尾蚴或者包囊，其中屬于帶科(Taeniidae)的帶屬(Taenia)和棘球?qū)?Echinococcus)絳蟲蚴蟲尤為重要。囊蟲常見于腦室、肌肉、腹腔、胸腔、眼球等部位[1]，是一類危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病即囊尾蚴病[2]，如豬帶絳蟲和亞洲帶絳蟲，呈世界性分布，尤其在發(fā)展中國(guó)家廣泛流行，全球有近百萬(wàn)人感染[3]。絳蟲的成蟲常寄生于機(jī)體的消化道內(nèi)，對(duì)機(jī)體主要是機(jī)械性損害，損害程度相對(duì)于幼蟲而言較輕。

只有部分絳蟲對(duì)人及畜禽危害嚴(yán)重，大多數(shù)物種并不危害人及經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，因此對(duì)這些物種的系統(tǒng)了解相對(duì)甚少，但是其作為絳蟲綱的成員，對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)的分類是對(duì)絳蟲學(xué)研究的一種貢獻(xiàn)，也是為研究其他對(duì)人及其經(jīng)濟(jì)動(dòng)物有危害絳蟲的一種借鑒。因此如何對(duì)絳蟲進(jìn)行準(zhǔn)確而系統(tǒng)的分類已經(jīng)成為眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)。同時(shí)，及時(shí)診斷、有效防治絳蟲病取決于對(duì)病原體的準(zhǔn)確鑒定。本文就目前已有的確定絳蟲分類方法做一簡(jiǎn)要綜述，主要從形態(tài)學(xué)、生活史以及分子生物學(xué)方法進(jìn)行闡述，為絳蟲分類工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 形態(tài)學(xué)方法

由于地理位置和生存環(huán)境的差異，物種為了適應(yīng)環(huán)境，自身的結(jié)構(gòu)將會(huì)做出相應(yīng)的改變，因此觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)的差異是區(qū)分不同物種的直接方式。觀察絳蟲發(fā)育各階段的形態(tài)與已報(bào)道過(guò)的物種間的差異，包括成蟲(吸附器官、頭節(jié)、生殖器官、成蟲大小)、卵(六鉤蚴)、蚴體(頭節(jié)的數(shù)量和形態(tài))等形態(tài)學(xué)特征是鑒定絳蟲的重要手段之一。

1.1成蟲形態(tài) 絳蟲成蟲主要由頭節(jié)、頸節(jié)和體節(jié)組成。頭節(jié)位于蟲體最前端，作為吸附和固定器官，絳蟲種類不同其形態(tài)結(jié)構(gòu)差異很大。圓葉目絳蟲的頭節(jié)膨大呈球形，其上有四個(gè)均勻排列的圓形或橢圓型吸盤，如副裸頭屬絳蟲。根據(jù)吸盤上有無(wú)小鉤也可將絳蟲進(jìn)行區(qū)分，裸頭科、帶科絳蟲吸盤上無(wú)小鉤，戴文科、雙殼科的吸盤上有或無(wú)小鉤。有些種類的頭節(jié)頂端中央有一個(gè)頂突，其上有一圈或數(shù)圈排列的小鉤，例如帶科絳蟲其頂突存在內(nèi)外兩圈排列的角質(zhì)化小鉤(牛帶絳蟲除外[4])，膜殼科絳蟲頂突上大多具有鉤且呈單圈排列，裸頭科絳蟲頭節(jié)無(wú)頂突。假葉目絳蟲頭節(jié)一般呈指形，背腹各有一溝樣吸槽，如寬節(jié)雙葉槽絳蟲。

同一科內(nèi)不同屬的成蟲長(zhǎng)度存在明顯差異，這在帶科絳蟲中區(qū)別比較明顯，如豬帶絳蟲(帶屬)成蟲全長(zhǎng)2-5 m；牛帶絳蟲(帶屬)成蟲一般長(zhǎng)5-10 m，最長(zhǎng)可達(dá)25 m；而細(xì)粒棘球絳蟲(E.granulosus，Eg，棘球?qū)?長(zhǎng)2-7 mm，多房棘球絳蟲(E.multilocularis，Em，棘球?qū)?成蟲長(zhǎng)僅為1.2-4.5 mm[5]。

此外，蟲體在顏色上也有不同，大多數(shù)絳蟲蟲體呈乳白色，但個(gè)別絳蟲存在差異如活體犬復(fù)孔絳蟲為淡紅色，貝氏莫尼茨絳蟲蟲體呈黃白色。蟲體生殖器官在同一科不同屬之間也有差異，如大裸頭絳蟲成節(jié)有一組生殖器官，生殖孔開口于一側(cè)；莫尼茨屬成節(jié)內(nèi)有兩組生殖器官，對(duì)稱分布于節(jié)片兩側(cè)，生殖孔開口于節(jié)片兩側(cè)。

Xiao等[6]在四川石渠縣狐貍體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種絳蟲，其形態(tài)與Em相似，然而這個(gè)新物種與Em的差別在于具有小吻鉤、較少的節(jié)片、成熟節(jié)片中生殖孔位置特殊和孕節(jié)中含有較少的蟲卵。這些特征確定其屬于棘球?qū)俚植煌谄渌N，最終確定為一個(gè)新種—石渠棘球絳蟲(Es)。

1.2幼蟲(蚴)形態(tài) 絳蟲都要經(jīng)蟲卵發(fā)育成六鉤蚴，再進(jìn)一步發(fā)育為幼蟲的階段。假葉目絳蟲的幼蟲經(jīng)歷兩個(gè)階段，蟲卵經(jīng)子宮排除后不會(huì)直接感染中間宿主，需要在水中發(fā)育后才能形成具有感染性的六鉤蚴，由于六鉤蚴表面有密布纖毛的胚膜，因此又稱為鉤毛蚴或鉤球蚴，六鉤蚴被第一中間宿主吞食后形成原尾蚴，原尾蚴為實(shí)心結(jié)構(gòu)，其前端有一凹陷處，末端有一小尾球，其內(nèi)有3對(duì)小鉤；原尾蚴進(jìn)入第二中間宿主后發(fā)育成實(shí)尾蚴，實(shí)尾蚴也具有實(shí)心結(jié)構(gòu)，無(wú)小鉤，具有成蟲樣頭節(jié)，但無(wú)鏈體和生殖器官，如裂頭蚴。

圓葉目絳蟲幼蟲分為似囊尾蚴和囊尾蚴兩種類型。似囊尾蚴為一個(gè)含有凹入頭節(jié)的雙層囊狀體，其一端具有尾巴樣結(jié)構(gòu)，如裸頭科絳蟲的蟲卵進(jìn)入中間宿主地螨體內(nèi)釋放出六鉤蚴，并逐漸發(fā)育成似囊尾蚴。囊尾蚴為一半透明囊體，囊內(nèi)充滿囊液，有頭節(jié)凹入。囊尾蚴的形態(tài)隨絳蟲種類有所不同。帶科絳蟲囊尾蚴差異比較明顯，如豆?fàn)钅椅豺食事褕A形，大小6～12 mm×4～6 mm，僅有一個(gè)頭節(jié)；腦多頭蚴為乳白色半透明的囊泡，呈圓形或卵圓形，直徑達(dá)5 cm或更長(zhǎng)，囊壁上含有100個(gè)左右的原頭蚴；細(xì)粒棘球蚴囊體可以產(chǎn)生無(wú)數(shù)個(gè)生發(fā)囊，每個(gè)生發(fā)囊又可產(chǎn)生許多原頭蚴；鏈狀囊尾蚴頭節(jié)則與囊泡之間形成很長(zhǎng)的鏈體。

形態(tài)學(xué)在絳蟲物種鑒定中起到了指引作用，通過(guò)形態(tài)學(xué)的分析能夠快速鑒定出其所屬的科、屬等分類地位，為進(jìn)一步鑒定奠定了基礎(chǔ)。Malsawmtluangi等[7]在印度東北部爆發(fā)嚙齒動(dòng)物囊尾蚴時(shí)，對(duì)采集到的囊尾蚴的形態(tài)進(jìn)行分析確定為帶科帶屬絳蟲的中絳期幼蟲，為分子生物學(xué)鑒定的引物設(shè)計(jì)提供了基礎(chǔ)。然而單純依靠形態(tài)學(xué)上的差別有時(shí)并不能完全區(qū)分兩個(gè)物種，例如亞洲帶絳蟲和牛帶絳蟲，其形態(tài)學(xué)幾乎完全相似，因此長(zhǎng)時(shí)間被認(rèn)為是同一個(gè)物種，直到對(duì)其線粒體基因組測(cè)序后才發(fā)現(xiàn)它們屬于兩個(gè)不同的種[8-9]。

2 生活史、宿主范圍、流行病學(xué)調(diào)查及生態(tài)學(xué)等方法

2.1生活史及宿主范圍 絳蟲發(fā)育比較復(fù)雜，不同物種間其生活史、宿主范圍存在差異，在其生活史中絕大多數(shù)需要一個(gè)或兩個(gè)中間宿主，個(gè)別寄生于人類和嚙齒動(dòng)物的絳蟲不需要中間宿主，如：短小膜殼絳蟲。假葉目絳蟲由于卵殼厚，蟲卵排除后不具有直接的感染性，需要經(jīng)過(guò)兩個(gè)中間宿主才能最終感染終末宿主；圓葉目絳蟲卵殼較脆弱，沒有卵蓋，在蟲卵脫離母體后，六鉤蚴已經(jīng)形成，因此可以直接感染中間宿主，只需一個(gè)中間宿主。廣義的細(xì)粒棘球絳蟲種內(nèi)變異現(xiàn)象突出，已發(fā)現(xiàn)的基因型(genotype)或蟲株(strain)至少10個(gè)：G1-G10以及獅棘球絳蟲(E.felids)，其中間宿主和終末宿主范圍及特異性上均存在著差別[10]。一些學(xué)者已建議將其中一部分基因型或者蟲株單獨(dú)列為種[11]。同時(shí)，地理位置的不同可能造成同一種絳蟲幼蟲存在宿主多樣性，Kataranovski等[12]報(bào)道巨頸絳蟲(T.taeniaeformis)幼蟲根據(jù)地理位置不同可以改變其寄生所需的中間宿主。

2.2流行病學(xué) 寄生蟲病流行病學(xué)調(diào)查內(nèi)容包括：生物因素、自然因素和社會(huì)因素。生物因素主要指寄生蟲與宿主等因素，絳蟲大多需要一個(gè)或兩個(gè)中間宿主，其宿主的分布及范圍因不同物種而存在差異；自然因素包括氣候、地理和生物種群等，直接影響著寄生蟲的分布和流行，如棘球蚴病(包蟲病)作為一種地方性流行病，在我國(guó)西北牧區(qū)普遍流行，這與當(dāng)?shù)氐纳锓N群(牛、養(yǎng)、嚙齒動(dòng)物及犬科動(dòng)物)密不可分；社會(huì)因素包括社會(huì)經(jīng)濟(jì)狀況、文化教育和科學(xué)技術(shù)水平、法律法規(guī)的制定和執(zhí)行、人們的生活方式、風(fēng)俗習(xí)慣等，如我國(guó)部分地區(qū)當(dāng)?shù)鼐用裼惺成獾牧?xí)慣，這往往導(dǎo)致豬囊蟲病的流行[5]。

絳蟲病流行病學(xué)調(diào)查的主要參考因素：寄生宿主、部位和感染率。以三種人體帶絳蟲(豬帶絳蟲、亞洲帶絳蟲及牛帶絳蟲)為例，豬作為豬帶絳蟲和亞洲帶絳蟲的主要傳播中間宿主，人類因分別誤食含有其幼蟲的豬肉(豬帶絳蟲蚴寄生部位)和肝臟(亞洲帶絳蟲蚴寄生部位)而被感染[13]， Hosseinzadeh[14]等報(bào)道牛帶絳蟲幼蟲主要寄生于牛的咬肌、心臟、膈肌，根據(jù)宿主和寄生部位的不同可以快速將這三種人體帶絳蟲種類鑒定出來(lái)。此外，在進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查時(shí)需要注意，地域差異可以導(dǎo)致不同的感染率，Kataranovski等[12]在西伯利亞野生溝鼠(Ratusnorvegicus)體內(nèi)檢測(cè)帶狀囊尾蚴(Cysticercusfasciolaris，巨頸帶絳蟲[T.taeniaformis]的幼蟲)感染率為29.9%；Wanas等[15]發(fā)現(xiàn)埃及嚙齒動(dòng)物(黑鼠、小家鼠、沙鼠)帶狀囊尾蚴廣泛流行(25%～41%)，而在美國(guó)嚙齒動(dòng)物中帶狀囊尾蚴流行率較低(6%～18%)[16-18]。選擇不同的地區(qū)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查所得感染率結(jié)果可能有存在出入，因此在對(duì)絳蟲物種進(jìn)行分類鑒定時(shí)要選擇一定的地理位置進(jìn)行流行病學(xué)分析。

2.3生態(tài)學(xué) 生態(tài)學(xué)在絳蟲分類鑒定上的應(yīng)用有助于快速尋找其宿主范圍，主要是指物種間食物鏈的關(guān)系。自然界生物間均存在著捕食與被捕食的關(guān)系，食草動(dòng)物一般作為肉食動(dòng)物的獵物，這為寄生蟲的發(fā)育繁殖提供了很好的便利條件。肉食動(dòng)物在捕食獵物時(shí)有其偏愛性，藏狐在青藏高原上主要以高原屬兔為食，這兩者之間形成食物鏈的一枝，因此在野生環(huán)境下以高原屬兔為中間宿主的多房棘球蚴和石渠棘球蚴其終末宿主往往是藏狐。而細(xì)粒棘球蚴常寄生于牛羊的肝臟和肺臟，在自然條件下，狼捕食牛羊，成為了細(xì)粒棘球絳蟲的終末宿主；同時(shí)隨著人類活動(dòng)的干涉，牛羊作為經(jīng)濟(jì)動(dòng)物飼養(yǎng)，在屠宰過(guò)程中發(fā)現(xiàn)有病變的臟器便喂給家養(yǎng)的狗，于是狗進(jìn)入了細(xì)粒棘球絳蟲的生活史。

3 免疫學(xué)方法

免疫學(xué)方法在診斷病原方面具有簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)點(diǎn)，常用方法有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、糞抗原ELISA(Copro-Ag ELISA)和免疫印跡法(IB)。目前，針對(duì)對(duì)人及家畜危害嚴(yán)重的棘球?qū)俳{蟲傳染源(犬等終末宿主)檢測(cè)開發(fā)了特異性的糞抗原ELISA檢測(cè)方法[19]，Hartnack等[20]利用糞抗原ELISA檢測(cè)糞樣中多房棘球絳蟲和細(xì)粒棘球絳蟲，靈敏性分別為55%和57%，特異性分別為76%和85%。盡管免疫學(xué)試驗(yàn)存在低靈敏性和交叉反應(yīng)等缺點(diǎn)，如豬囊蟲的血清(免疫)學(xué)試驗(yàn)與細(xì)頸囊尾蚴感染(泡狀帶絳蟲T.hydatigena的幼蟲)之間存在交叉反應(yīng)[21]，但針對(duì)抗原的ELISA和IB在非洲等國(guó)家仍然作為豬囊蟲流行病學(xué)調(diào)查的主要手段[21]。帶屬絳蟲糞抗原ELISA作為一種非商品化的診斷試劑盒具有相對(duì)于針對(duì)抗體的ELISA更高的靈敏性并在一些研究中得到了應(yīng)用[22]，但診斷人囊尾蚴病時(shí)，IB的敏感性卻高于糞抗原ELISA[23]。免疫學(xué)方法的建立為臨床上快速、準(zhǔn)確地診斷絳蟲病病原提供了基礎(chǔ)，只能檢測(cè)已知蟲種，對(duì)未知蟲種的鑒定方面存在缺陷。

4 分子生物學(xué)方法

4.1常規(guī)PCR及測(cè)序技術(shù) 隨著PCR的普遍應(yīng)用及測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，不同蟲種及同種不同分離株的絳蟲線粒體基因和核基因序列愈來(lái)愈多地被提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，尤其是近年來(lái)對(duì)絳蟲線粒體基因組和核基因組測(cè)序工作的完成，為人們從基因水平對(duì)絳蟲分類鑒定提供大量豐富的數(shù)據(jù)，因此也成為了眾多學(xué)者研究的焦點(diǎn)。目前完成的絳蟲線粒體全基因組序列共32個(gè)，其中帶屬16個(gè)種，棘球?qū)?個(gè)種(包括10個(gè)基因型)，膜殼屬1個(gè)種，裸頭科4個(gè)種，雙殼科1個(gè)種，迭宮屬1個(gè)種，雙葉槽屬2個(gè)種，復(fù)殖孔屬2個(gè)種；核基因組5個(gè)。

4.1.1線粒體基因在絳蟲分類鑒定中的應(yīng)用 線粒體作為真核細(xì)胞特有的器官存在于細(xì)胞質(zhì)中，包含生物體呼吸氧化所需酶的編碼基因，在細(xì)胞內(nèi)代謝旺盛，當(dāng)外界環(huán)境改變時(shí)，其所攜帶的遺傳信息較易發(fā)生改變，線粒體DNA以高頻率發(fā)生突變，其突變頻率是核DNA的10倍；此外，線粒體攜帶極少的非編碼區(qū)DNA，無(wú)內(nèi)含子，其進(jìn)化速度較核基因組迅速，因此常在分類學(xué)中得到應(yīng)用[24]。研究線粒體基因序列變異，為人們從分子水平上對(duì)物種進(jìn)行細(xì)致分類鑒定提供了很好的工具。目前，線粒體基因已廣泛應(yīng)用于蟲種、蟲株的鑒定和鑒別，建立臨床樣品分子生物學(xué)診斷方法和發(fā)展檢測(cè)技術(shù)，研究物種起源與進(jìn)化和比較基因組學(xué)研究等。

絳蟲mtDNA為雙鏈閉環(huán)分子，核苷酸數(shù)目在13.4kb-13.8kb之間，共有36個(gè)編碼基因，其中編碼蛋白質(zhì)的基因有12個(gè)，編碼tRNA的基因22個(gè)，編碼rRNA的基因2個(gè)，約60%編碼蛋白質(zhì)的基因編碼NADH-Q還原酶的7個(gè)亞基(nad1-6及nad4L)，其余的用于編碼細(xì)胞色素還原酶的一個(gè)亞基(cob)、細(xì)胞色素氧化酶的3個(gè)亞基(cox1-3)以及ATP合成酶的一個(gè)亞基(atp6)。

線粒體基因組做為分子遺傳標(biāo)記在絳蟲物種的分類鑒定中得到了普遍應(yīng)用，Xiao等[6]在我國(guó)四川石渠縣發(fā)現(xiàn)的一種絳蟲，對(duì)其線粒體nad1、cox1、atp6、cob、rrnL基因序列分析后，發(fā)現(xiàn)該絳蟲不同于棘球?qū)俚钠渌N，并根據(jù)發(fā)現(xiàn)地命名為石渠棘球絳蟲。Malsawmtluangi等[7]在印度東北部米佐拉姆邦地區(qū)收集的嚙齒動(dòng)物囊尾蚴，對(duì)其形態(tài)學(xué)特征、核糖體DNA(ITS1，ITS2)以及線粒體cox1進(jìn)行測(cè)序分析，確定其為帶狀囊尾蚴。此外線粒體基因序列在細(xì)粒棘球蚴10個(gè)基因型的分離鑒定中起到了關(guān)鍵作用，這10個(gè)基因型在蟲體形態(tài)、幼蟲形態(tài)、宿主特異性(范圍)、地理分布、致病性方面均存在差異，線粒體序列將這10個(gè)基因型準(zhǔn)確分類，打破了以往對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲種認(rèn)識(shí)的局限性，為以后的防治和研究工作奠定了基礎(chǔ)；Jeon等通過(guò)對(duì)這亞洲帶絳蟲和牛帶絳蟲的線?；蚪M全序列的測(cè)定，比對(duì)分析結(jié)果表明這兩種絳蟲線粒體基因組核苷酸序列的差異為5.6%，與豬帶絳蟲(T.solium)線粒體基因組序列的差異為 11%，最終確定了亞洲絳蟲的獨(dú)立種地位及這3種絳蟲的親緣關(guān)系，為臨床診斷和防治等工作奠定了基礎(chǔ)[8,25-27]。

然而，線粒體基因哪部分可以作為理想的分子靶標(biāo)來(lái)區(qū)分物種，長(zhǎng)期困擾著研究絳蟲分類鑒定的學(xué)者，傳統(tǒng)分子生物學(xué)鑒定主要依靠nad1和cox1序列的比對(duì)分析，但這并不代表nad1和cox1序列是線粒體基因中變異程度最大的，而是因?yàn)檫@些基因兩端臨近部位存在保守區(qū)域，為引物的設(shè)計(jì)提供了很好的位點(diǎn)[28]。在棘球?qū)僦衝ad1的變異率要大于cox1，McManus等[29]對(duì)細(xì)粒棘球蚴的11個(gè)基因型種內(nèi)及與多房棘球蚴、少節(jié)棘球蚴和福氏棘球蚴種間的cox1序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)差異分別為5%～9%和6%～11.5%，而nad1序列差異分別為7%～15%和13%～16%。大量文獻(xiàn)表明，nad1和cox1序列在線粒體基因上的變異程度并沒有其他基因大，Xiao等[6]分析了Es與Em和Eg(G1型)線粒體上5個(gè)基因nad1(897 bp)、cox1(1608 bp)、atp6(513 bp)、cob(1608 bp)、rrnL(985 bp)，發(fā)現(xiàn)種間差異最小的是cox1(分別為：7.8%～10.6%)，而差異最大的則是atp6(分別為：18.4%～22.1%)；同時(shí)，Jia等[30]對(duì)帶屬中的7個(gè)種的線粒體全序列利用DnaSP v.5軟件進(jìn)行了變異程度統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明nad5差異程度最高，其次是nad6、atp6等，與以往報(bào)道過(guò)差異較大的基因(nad6、nad5、atp6、nad3、nad2)相吻合。然而存在的問題是，這些變異程度較大的序列是否在同一個(gè)物種不同分離株間也存在著較大的差異，是否可以作為絳蟲分類鑒定的依據(jù)還需進(jìn)一步驗(yàn)證。隨著不同絳蟲蟲種線粒體全基因組序列的增加，將有助于尋找絳蟲分類鑒定工作中理想的分子靶標(biāo)基因。

4.1.2核基因在絳蟲分類鑒定上的應(yīng)用 核基因存在于真核生物的細(xì)胞核內(nèi)，在絳蟲分類鑒定時(shí)常用基因?yàn)楹颂求wRNA基因以及衛(wèi)星DNA序列。后者以其高突變率越來(lái)越受到研究學(xué)者的青睞，尤其是在鑒定種間差異和隱藏種中得到越來(lái)越多的應(yīng)用[31-34]，如Em中極微的遺傳變異都能被檢測(cè)到[33]。

4.1.2.1核糖體RNA基因(rRNA) 核糖體RNA基因組成依次為18S、ITS1、5.8S、ITS2和28S，其中ITS被5.8S隔開，分成ITS1和ITS2。28S和18S分別參與核糖體大小亞基的組成。ITS的變異頻率較5.8S、18S及28S都高，在進(jìn)行屬間進(jìn)化分析時(shí)常用到5.8S、18S及28S作為輔助參考數(shù)據(jù)；種間區(qū)分時(shí)則不常使用，而是常用ITS(ITS1和ITS2)，其中ITS1的變異程度要大于ITS2。Drogemuller等[35]對(duì)葉狀裸頭科絳蟲(A.perfoliata)和侏儒副裸頭絳蟲(P.mamillana)的ITS、5.8S、18S及28S序列擴(kuò)增并進(jìn)行分析，結(jié)果表明，5.8S、18S及28S序列具有很高的相似性，而ITS相似度較低，ITS1和ITS2的一致性分別為39.8%～43.5%和59.5%～61.2%。

4.1.2.2衛(wèi)星DNA序列 真核生物基因組中復(fù)性最快的組分是由很短的串聯(lián)重復(fù)序列拷貝構(gòu)成的較大序列簇，重復(fù)序列的堿基組成與基因組的平均組成有較大差別，其浮力密度不同，這些序列能夠形成獨(dú)立的條帶，這樣的條帶就是衛(wèi)星DNA。根據(jù)短重復(fù)序列單位長(zhǎng)度不同分為微衛(wèi)星序列(長(zhǎng)度小于10 bp)和小衛(wèi)星序列(長(zhǎng)度在10～100 bp)。衛(wèi)星DNA位于異染色質(zhì)區(qū)域，定位于著絲粒處。個(gè)體基因組微衛(wèi)星或小衛(wèi)星序列間存在著差異，小衛(wèi)星序列中發(fā)生遺傳交換的頻率很高，為10-4/kb DNA，是衛(wèi)星序列間重組頻率的10倍，小衛(wèi)星DNA序列的高度變異性可用來(lái)清楚地研究種間的遺傳關(guān)系，目前在絳蟲分類上微衛(wèi)星或小衛(wèi)星序列也已經(jīng)得到應(yīng)用，這為區(qū)分差異較小的物種提供了新的手段和方法。微衛(wèi)星序列作為分子遺傳標(biāo)志具有3個(gè)重要的特征：敏感性、重復(fù)性和強(qiáng)大的區(qū)分性[36-38]。

了解Em的種群動(dòng)態(tài)對(duì)制定防控策略是非常重要的，Em從常規(guī)遺傳學(xué)標(biāo)志來(lái)看是非常保守的，而其微衛(wèi)星序列方面存在明顯差異。Em微衛(wèi)星序列(EmsB)，由CA和GA重復(fù)序列組成，目前已經(jīng)作為一個(gè)新的工具研究Em的遺傳多樣性，Knapp[39]等利用EmsB對(duì)歐洲Em流行地區(qū)的樣品進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)阿爾皮斯山北部流行地區(qū)相對(duì)于其他地區(qū)存在較高的遺傳差異。同時(shí)EmsB在細(xì)粒棘球絳蟲分類中也得到了應(yīng)用，Maillard[40]等對(duì)采自6個(gè)不同的國(guó)家樣品進(jìn)行了分析，依據(jù)傳統(tǒng)線粒體序列(nad1和cox1)可將這些樣品分為三個(gè)大類，而EmsB分析結(jié)果則顯示更加深度的遺傳差異并能區(qū)分小范圍內(nèi)的變異。

4.1.2.3其他核DNA序列 其他核DNA序列在絳蟲分類上應(yīng)用較多的為：RNA 聚合酶Ⅱ第二亞基基因 (rpb2)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因(pepck)和DNA聚合酶δ亞基基因(pold)。由于絳蟲屬自體受精，因此這些基因位點(diǎn)上很少發(fā)生異體雜交現(xiàn)象[41]，但這些序列數(shù)據(jù)比較缺乏，目前僅主要應(yīng)用于絳蟲系統(tǒng)進(jìn)化分析的研究。帶科絳蟲主要包括帶屬和棘球?qū)賰蓚€(gè)屬，這兩個(gè)屬對(duì)人及動(dòng)物健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。棘球?qū)儆捎谄湎嗨频男螒B(tài)學(xué)、發(fā)育特征和基因組分而獨(dú)立成一個(gè)屬。為了研究這兩個(gè)屬之間的進(jìn)化關(guān)系，分子標(biāo)志信息的比較是唯一區(qū)分它們的方法，Knapp等[42]選擇編碼蛋白質(zhì)的3個(gè)核基因rpb2、pepck和pold作為遺傳學(xué)標(biāo)志，利用貝葉斯推理構(gòu)建進(jìn)化樹進(jìn)行分析， 結(jié)果顯示帶屬并不是包括全部同一祖先后裔在內(nèi)的單系物種群即為并系群，帶狀帶絳蟲(T.taeniaeformis)、微小帶絳蟲(T.parva)與其他所有帶屬種及棘球?qū)俜诸惾撼省版⒚谩标P(guān)系，而T.mustelae則與棘球?qū)俪省版⒚谩标P(guān)系 。Saarma等[11]通過(guò)對(duì)棘球?qū)?段核基因序列包括延伸因子1α基因(ef1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體激酶基因(tgf)、硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶基因(th)、鈣網(wǎng)蛋白基因(cal)和埃茲蛋白-根蛋白-膜突蛋白樣蛋白基因(elp)的測(cè)定，利用貝葉斯推理構(gòu)建進(jìn)化關(guān)系，得出在棘球?qū)賰?nèi)核DNA比線粒體DNA能更好地反映出棘球?qū)俳{蟲系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，提示線粒體DNA不是唯一用來(lái)做進(jìn)化分析的理想分子靶標(biāo)。

4.2其他分子生物學(xué)方法 在絳蟲病進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查和疾病防控時(shí)，簡(jiǎn)便、快速、靈敏的確定絳蟲物種顯得尤為重要。單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析是基于單鏈DNA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，當(dāng)堿基發(fā)生改變時(shí)會(huì)使其空間構(gòu)象發(fā)生改變的原理，通過(guò)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)將構(gòu)象差異的分子分離開，在絳蟲蟲種鑒定方面得到了應(yīng)用。Sharbatkhori等[43]采集了148個(gè)細(xì)粒棘球蚴分離株，對(duì)cox1和nad1兩個(gè)基因進(jìn)行了SSCP分析，電泳結(jié)果顯示cox1和nad1分別有5個(gè)和9個(gè)條帶，對(duì)這些條帶分別測(cè)序后發(fā)現(xiàn)不同條帶的序列都存在差異，甚至單核苷酸的差異也能很容易被檢測(cè)出來(lái)。SSCP分析技術(shù)以其高靈敏性在絳蟲分類鑒定中起到快速定種的作用，為人們?cè)谶M(jìn)行臨床檢查是提供了方便。此外，多位點(diǎn)酶電泳法(MEE)和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)(RFLP)作為分子方法同樣有助于對(duì)寄生于不同宿主的細(xì)粒棘球蚴種的鑒定和描述[44]。

5 種間雜交在絳蟲分類鑒定上應(yīng)用

目前對(duì)自然條件下扁形動(dòng)物門寄生蟲種間雜交了解甚少，分子遺傳學(xué)證據(jù)表明在吸蟲綱分體科部分吸蟲存在種間雜交現(xiàn)象[45]。核DNA作為分子遺傳標(biāo)志可以鑒定物種間雜交的重要依據(jù)，常用序列有ef1、elp、mdh、EgAgB4。elp基因編碼三個(gè)緊密相關(guān)的蛋白質(zhì)：埃茲蛋白、根蛋白、膜突蛋白，最早因作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞皮質(zhì)的構(gòu)成元件而被發(fā)現(xiàn)，主要分布在肌動(dòng)蛋白豐富的表面結(jié)構(gòu)(如：微絨毛、絲狀偽足及細(xì)胞膜皺褶部位)。

亞洲帶絳蟲和牛帶絳蟲因其極相似的形態(tài)學(xué)而長(zhǎng)時(shí)間被認(rèn)為是同一個(gè)物種，線粒體序列將亞洲帶絳蟲從牛帶絳蟲中分離出來(lái)成為一個(gè)獨(dú)立的物種，但兩個(gè)物種間存在著雜交關(guān)系。Okamoto等[46]報(bào)道ef1有3個(gè)等位基因(ef1A、ef1B和ef1C)，ef1A和ef1B存在于亞洲帶絳蟲，ef1C存在于牛帶絳蟲；elp基因有4個(gè)等位基因(elpA、elpB、elpC和elpD)，其中elpA和elpB起源于亞洲帶絳蟲，elpC和elpD起源于牛帶絳蟲。Yamane等[47]從我國(guó)四川青藏高原分離5株人體帶絳蟲(Taeniaspp.)，對(duì)其核基因ef1和elp測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中兩株成蟲是源于亞洲帶絳蟲和牛帶絳蟲的雜交；Xiao等[4]分析石渠棘球絳蟲elp發(fā)現(xiàn)其與其他棘球?qū)俳{蟲種之間不存在雜交現(xiàn)象。目前的研究建議將一些不同細(xì)粒棘球蚴分離株歸為單獨(dú)種，但是缺少核基因分子標(biāo)志數(shù)據(jù)，Badaraco等[48]對(duì)不同地區(qū)細(xì)粒棘球蚴分離株(G1、G2、G5、G6和G7)的mdh和EgAgB4基因進(jìn)行分析，mdh含有3個(gè)等位基因(MD1-MD3)，EgAgB4有兩組序列(EgAgB4-1和EgAgB4-2)，在G1和G2基因型(蟲株)單倍體中等位基因MD1、MD2和EgAgB4-1出現(xiàn)頻率較高，G5、G6和G7基因型(蟲株)單倍體中等位基因MD3和EgAgB4-2出現(xiàn)頻率較高，然而巴西G1分離株則為MD2和MD3的雜合子。絳蟲種間雜交現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為我們?cè)阼b定絳蟲分類鑒定時(shí)提供了新的方向，使得絳蟲分類有更加準(zhǔn)確的描述成為可能。

6 結(jié) 語(yǔ)

絳蟲分類鑒定目前尚無(wú)一整套系統(tǒng)完整的方法可以參照。主要依據(jù)其形態(tài)學(xué)、生活史、宿主范圍、流行病學(xué)調(diào)查、生態(tài)學(xué)以及分子生物學(xué)分析等綜合方面進(jìn)行鑒定和區(qū)分，這些手段在物種鑒定中都是不可或缺的。形態(tài)學(xué)的鑒定可以快速地對(duì)某一未知物種進(jìn)行判斷，為下一步準(zhǔn)定定位縮小了范圍，但其缺點(diǎn)就是不能準(zhǔn)確定種，尤其是對(duì)亞種或隱藏種的發(fā)現(xiàn)，使得形態(tài)學(xué)鑒定越來(lái)越相形見絀。寄生蟲大多具有宿主特異性，而且呈現(xiàn)區(qū)域性分布，但隨著人類活動(dòng)的干涉，部分絳蟲的宿主范圍和地理分布呈現(xiàn)擴(kuò)大趨勢(shì)，這對(duì)我們根據(jù)已有生活史、宿主范圍、流行病學(xué)調(diào)查和生態(tài)學(xué)資料進(jìn)行鑒定時(shí)起到很大的干擾，研究也表明不同地理位置的同一物種其宿主范圍有很大變化。

隨著分子生物學(xué)以及生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，在絳蟲物種的鑒定方面，越來(lái)越趨向于利用基因間的差異。寄生蟲的基因組不會(huì)因?yàn)榄h(huán)境、宿主、不同發(fā)育階段以及翻譯后修飾等因素的誘導(dǎo)而發(fā)生變異。不同物種間核基因組和線粒體基因組均存在著遺傳差異，基于DNA序列分析為人們了解全球生物生態(tài)多樣性提供了很好的工具。線粒體基因作為絳蟲物種分類鑒定的熱點(diǎn)，從分子水平上對(duì)物種間的遺傳多樣性進(jìn)行分析，同時(shí)由于其高突變率，不同物種間差異較大等特征，一直成為學(xué)者們樂于使用的工具，但也存在不足之處，如不同個(gè)體間序列差異達(dá)到多少時(shí)才能證明是屬于不同種；線粒體上哪些基因更適合作為遺傳標(biāo)志；同一物種不同個(gè)體間序列差異多少時(shí)才能定為一個(gè)亞種或隱藏種等，這些問題將有望隨著線粒體全基因組測(cè)序的完成以及深入研究而得到解決。微衛(wèi)星DNA以其高突變率，在絳蟲分類學(xué)上作為一種新的工具，幫助我們深度分析種內(nèi)遺傳變異。

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