徐 龍，葛林梅，郜海燕，陳杭君

（1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江金華 321004；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 310021）

黑莓花色苷提取純化及抗氧化研究進(jìn)展

徐 龍1，2，葛林梅2，郜海燕2，陳杭君2

（1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江金華 321004；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 310021）

花色苷是一種廣泛存在于植物中的功能性水溶色素。黑莓果實(shí)中含有豐富的花色苷,具有重要的生物和抗氧化活性,受到食品、藥品、化妝品等行業(yè)的青睞。本文介紹了黑莓花色苷結(jié)構(gòu)組成,提取、分離純化方法和抗氧化活性等方面的研究現(xiàn)狀,為進(jìn)一步開展黑莓花色苷研究提供參考。

黑莓；花色苷；提取純化；抗氧化活性

黑莓 （Rubus spp.）是多年生藤本植物,屬于薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（Rubus）實(shí)心莓亞屬。果實(shí)柔軟多汁,營養(yǎng)豐富,色澤宜人,香味獨(dú)特,含有人體必需的17種氨基酸和維生素,食之消暑生津、止渴除痰、醒酒提神。更為重要的是,黑莓果實(shí)中花色苷等具有抗氧化、抗衰老和抗癌變功能的多酚類物質(zhì)含量非常豐富［1］,每100 g果實(shí)中的花色苷含量為67.4～230.0 mg［2］,大多屬于矢車菊類花色苷,其中含量最多的矢車菊-3-O-葡萄糖苷占到花色苷總量的80%以上［3］。因此,黑莓被稱之為 “生命之果”,在歐洲許多國家都有著悠久而廣泛的栽培歷史,是重要的漿果類果樹之一［4］。

花色苷 （Anthocyanin）是自然界中廣泛存在的一種天然水溶性色素,是花青素與各種糖結(jié)合而形成的黃酮多酚類化合物。花色苷主要存在于植物的細(xì)胞液中,以天竺葵色素（Pelargonidin）、矢車菊素 （Cyanidin）、飛燕草色素 （Delphinidin）為主,是植物體花、葉、果實(shí)和蔬菜呈現(xiàn)一系列顏色,特別是紅、紫、藍(lán)等顏色的物質(zhì)基礎(chǔ)。黑莓花色苷提取物在體外具有很強(qiáng)的抗氧化活性,因其有益健康的潛質(zhì)而被學(xué)界重視［5］。研究表明,花色苷抗氧化的途徑主要有①抑制自由基的產(chǎn)生或直接清除自由基?；ㄉ涨宄杂苫墓δ苤饕c其分子中的羥基有關(guān),特別是3-位或3′-、4′-、5′-位羥基有關(guān)。②激活抗氧化酶體系。通過激活過氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等來達(dá)到清除自由基、抗氧化的效果。③與誘導(dǎo)氧化的金屬元素絡(luò)合,直接降低脂蛋白 （LDL）的氧化程度,或通過抑制Fenton反應(yīng)從而抑制活性氧自由基產(chǎn)生。

本文概述了近些年國內(nèi)外學(xué)者關(guān)于黑莓花色苷組成,提取純化方法,抗氧化活性及藥用價(jià)值等方面的研究進(jìn)展,以期為進(jìn)一步研究及開發(fā)功能性天然色素提供參考。

l 黑莓花色苷的組成

花色苷種類繁多,是果蔬中重要的多酚類物質(zhì)之一［6］。Stintzing等［7］對野生黑莓果實(shí)花色苷組分進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)黑莓花色苷主要為矢車菊色素,即植物體紫色的主要呈色物質(zhì),成分有矢車菊-3-O-葡萄糖苷、矢車菊-3-O-蕓香糖苷、矢車菊-3-O-木糖苷、矢車菊-3-O-半乳糖糖苷、天竺葵-3-O-葡萄糖苷、錦葵-3-O-葡萄糖苷等。李倩等［8］的研究也表明,矢車菊-3-O-葡萄糖苷、矢車菊-3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊-3-O-蕓香糖苷和錦葵色素-3-O-葡萄糖苷等為花色苷主要組分。其中以矢車菊-3-O-葡萄糖苷含量最高,約占花色苷總量的85%［9］。

2 黑莓花色苷的提取

目前,提取花色苷的主要方法有：有機(jī)溶劑萃取法、生物酶解法、超聲波輔助法、超臨界提取法和高脈沖電場輔助提取法等,其中以有機(jī)溶劑萃取法最為常見。

2.1 有機(jī)溶劑萃取法

花色苷具有酸性和堿性基團(tuán),易溶于水、甲醇、乙醇、丙酮等極性溶劑?；ㄉ赵谌鯄A性溶液和中性溶液中不穩(wěn)定,可采用酸性甲醇溶液作為溶劑［10］。為防止花色苷降解,提高花色苷溶出率,常在溶劑中加少量的無機(jī)酸或有機(jī)酸,控制提取液的pH在3.5以下。甲醇的提取率比乙醇高20%,比水高70%［11］。Revilla等［12］比較了葡萄花色苷的幾種提取方法,結(jié)果表明體積分?jǐn)?shù)1%的HCl-甲醇溶液提取效果最好。趙慧芳等［13］同樣認(rèn)為,1%的HCl-甲醇溶液對黑莓凍果中花色苷的提取效果要優(yōu)于其他溶劑。但也有研究認(rèn)為,丙酮的提取效果比酸化甲醇、酸化乙醇更好,而且可以消除果膠的影響,降低提取溫度。

由于甲醇、丙酮具有毒性,在食用色素生產(chǎn)中常選用其他無毒或毒性較小的提取劉。Pergola等［14］采用1% （V/V）鹽酸-乙醇提取了榨汁后黑莓渣中的花色苷；程林潤等［15］以0.2%鹽酸水溶液提取紫甘薯花色苷。但鹽酸-乙醇溶液在提取花色苷的過程中會改變色素的原始狀態(tài),因此生產(chǎn)中以一定濃度的乙醇溶液為最佳。趙伯濤等［16］采用正交試驗(yàn)研究了30%～70%的乙醇溶液對榨汁后黑莓中色素的提取效果,發(fā)現(xiàn)最佳提取條件為乙醇濃度70%、溫度25℃、提取時(shí)間1 h。

影響有機(jī)溶劑萃取效果的因素很多,包括溶劑種類、料液比、pH值、溫度、提取次數(shù)和樣品顆粒大小等。溶劑萃取法投資量少,設(shè)備簡單易操作。目前,已經(jīng)有許多研究分別采用甲醇、乙醇、丙酮與水進(jìn)行配比,對各種來源的花色苷進(jìn)行萃取,為今后的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

2.2 生物酶解法

由于花色苷存在于細(xì)胞內(nèi)或吸附在細(xì)胞壁上,使得對花色苷的提取較為困難。針對細(xì)胞壁的主要成分,可采用纖維素酶和果膠酶對細(xì)胞壁進(jìn)行降解,使細(xì)胞內(nèi)的成分溶出,以達(dá)到提取目的。研究表明,采用纖維素酶或果膠酶水解均能達(dá)到提取果實(shí)中花色苷的目的,其中以纖維素酶的提取效果較佳,且使用2種酶復(fù)合提取效果要優(yōu)于單獨(dú)使用1種酶［17-18］。劉瑞軍等［19］優(yōu)化了酶解加酸提取越橘花色苷的條件,即酶用量2%、溫度為55℃、酶解時(shí)間1 h。盧鋒波等［20］對黑莓花色苷的酶解提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明在加酶量為0.21%、酶解溫度42.7°C、酶解1.46 h時(shí),花色苷產(chǎn)量最高。大量試驗(yàn)共同表明,影響生物酶解萃取效率的主要因素有加酶量、酶解溫度和酶解時(shí)間。

2.3 超聲波輔助提取法

超聲波是指頻率大于20 000 Hz的機(jī)械波,在媒介中傳播可以產(chǎn)生多種效應(yīng),如空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)。在對花色苷進(jìn)行提取時(shí),超聲波能促使細(xì)胞壁破裂,從而使有效成分從細(xì)胞液中釋放出來。此法操作簡單、提取率高、提取速度快,且所提取成分的結(jié)構(gòu)不易受到破壞。影響超聲波輔助提取的因素主要有超聲波功率、超聲時(shí)間、超聲溫度。

徐懷德等［21］使用超聲波輔助法提取黑莓果實(shí)中花色苷,優(yōu)化后的工藝參數(shù)為,超聲波功率526.9 W,時(shí)間30.5 min,提取溫度70.9℃。陳鋼等［22］以75%乙醇作溶劑,在料液比1∶20（V/m）的條件下超聲 35 min,黑莓花色苷的得率為0.365 mg·g-1。孟憲軍等［23］認(rèn)為藍(lán)莓花色苷最佳提取參數(shù)為,以52.28%體積分?jǐn)?shù)的乙醇作為提取液,提取溫度39.27℃,提取時(shí)間37.17 min。

2.4 超臨界CO2提取法

超臨界CO2提取技術(shù)以超過臨界溫度和壓力的流體作為溶劑,是近幾年發(fā)展起來的一種新技術(shù)。與傳統(tǒng)的溶劑萃取相比,其安全性好、提取時(shí)間短、得率高、萃取量大,特別適用于提取或精制熱敏性和易氧化的物質(zhì)。影響超臨界 CO2提取效率的因素有萃取力、萃取溫度和萃取時(shí)間等。張樹寶［24］利用超臨界CO2提取技術(shù)對大花葵花色苷進(jìn)行萃取,優(yōu)化的提取條件為：料液比1∶25,萃取壓力25 MPa,萃取溫度60℃,萃取時(shí)間45 min。研究表明,超臨界CO2提取法可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的有機(jī)溶劑萃取法來提取花色苷,且CO2安全價(jià)廉,無污染,無溶劑殘留,有利于熱敏性物質(zhì)萃取,特別適用于醫(yī)藥和食品工業(yè)。

2.5 高壓脈沖電場輔助提取法

高壓脈沖電場 （PEF）輔助提取法是一種新興的提取技術(shù),目前已經(jīng)開始應(yīng)用于食品加工中,尤其是液態(tài)食品的滅酶殺菌。其原理是高壓脈沖電場施加給細(xì)胞膜的脈沖電壓超過了細(xì)胞膜本身的電位,從而擊穿細(xì)胞膜,提高細(xì)胞膜的通透性,使細(xì)胞內(nèi)的有效成分充分釋放出來［25］。張燕等［26］研究了高壓脈沖電場處理對紅莓花色苷提取過程的影響,結(jié)果表明,PEF處理對紅莓果實(shí)液泡細(xì)胞膜的損傷比冷凍-解凍過程的機(jī)械損傷更顯著,有利于提高膜的通透性,使花色苷從細(xì)胞內(nèi)充分釋放。金聲瑯等［27］用高壓脈沖電場技術(shù)輔助提取番茄皮渣中的番茄紅素,提取率能達(dá)到96.7%,是常規(guī)有機(jī)溶劑提取率的2.4倍,是微波輔助法的1.23倍,是超聲波輔助法的1.04倍,且處理時(shí)間短（16μs）。

超臨界CO2提取法與高壓脈沖電場輔助提取法都是新興的提取技術(shù),均具有時(shí)間短,得率高等優(yōu)點(diǎn)。但這2種技術(shù)在黑莓花色苷提取上鮮有報(bào)道,如何把新興的提取技術(shù)運(yùn)用到黑莓花色苷的提取上,還需要學(xué)者進(jìn)一步研究。

3 黑莓花色苷的分離純化

目前,國內(nèi)外學(xué)者圍繞花色苷的分離純化進(jìn)行了大量研究。Da Costa等［28］用毛細(xì)管電泳法分離純化了黑加侖色素。還有學(xué)者利用SePPakeartridge C18柱和高效液相色譜 （HPLC）對花色苷進(jìn)行純化［29］。McCallum等［30］用離子交換及倒相分離結(jié)合的HPLC方法分析了葡萄中的花色苷。Luque-Rodríguez等［31］用熱乙醇溶液從葡萄皮果渣中提取出花色普及其他酚類物質(zhì),并用分光光度法及HPLC將提取出的物質(zhì)進(jìn)行定性及定量分析。Renault等［32］用離心分配色譜法將白葡萄及黑加侖中的花色苷進(jìn)行純化。Du等［33］用高速反相電流色譜法分離了從越桔中提取的花色苷。

黑莓花色苷大多采用樹脂進(jìn)行純化。閆寧環(huán)［34］研究了18種大孔吸附樹脂對黑莓色素的吸附特性,結(jié)果表明HPD-100A樹脂的吸附效果最好,與徐懷德等［35］研究結(jié)果一致。 王悅宏［36］分別以磺酸基陽離子樹脂、HPD400大孔吸附樹脂、HPD600大孔吸附樹脂和聚酷胺樹脂作為柱層析的填料,精制黑莓色素的粗提物,得率依次為HPD400樹脂＞HPD600樹脂＞磺酸基陽離子樹脂＞聚酷胺樹脂,依色價(jià)排序則為磺酸基陽離子樹脂＞聚酷胺樹脂＞HPD600樹脂＞HPD400樹脂。趙慧［37］在用大孔樹脂純化黑莓提取物中的花色苷時(shí)發(fā)現(xiàn),以AB-8大孔樹脂作為吸附劑較好。張麗霞等［38］研究同樣表明,大孔樹脂AB-8對黑莓花色苷具有較好的吸附與解吸能力。在此條件下產(chǎn)品的得率為 1.22%,花色苷回收率 75.45%,純度86.50%。

4 黑莓花色苷的抗氧化活性及藥用研究

自由基可導(dǎo)致脂肪、蛋白質(zhì)、核酸和糖分子的氧化損害,是一些疾病的重要病因?；ㄉ帐亲钣行У奶烊凰苄宰杂苫宄齽┲?能有效吸收羥自由基 （·OH）、超氧陰離子 （O2-·）和H2O2等,可防止大分子物質(zhì)的氧化損傷,具有很強(qiáng)的清除自由基的能力［39］。同時(shí)花色苷還通過激活抗氧化防御體系,例如激活過氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等來達(dá)到抗氧化效果。因此,富含花色苷的水果都具有很強(qiáng)的抗氧化活性,如黑莓［40］, 藍(lán)莓［41］和山核桃等［42］。

Koca等［43］對不同品種的黑莓和藍(lán)莓果實(shí)的抗氧化活性進(jìn)行研究,以FRAP（ferric reducing antioxidant power）作為體現(xiàn)果實(shí)抗氧化能力的指標(biāo),結(jié)果表明：黑莓和藍(lán)莓中花色苷含量分別為0.95～1.97 mg·g-1和0.18～2.94 mg·g-1,總酚含量分別為1.73～3.79 mg·g-1和0.77～5.42 mg·g-1。野生藍(lán)莓的花色苷和總酚含量比野生黑莓的要高,然而野生黑莓的抗氧化活性比野生藍(lán)莓要強(qiáng),野生黑莓的抗氧化活性范圍為 35.05～70.41μmol·g-1,而野生藍(lán)莓的活性范圍為7.41～57.92μmol·g-1。Wang等［44］使用MJ對3種品種黑莓進(jìn)行處理 （涂抹 0.1 mm和 0.01 mm）,對黑莓的抗氧化活性及抗癌作用進(jìn)行評估。結(jié)果表明,與對照相比,MJ處理能夠有效提高果實(shí)的抗氧化活性,0.1 mm處理效果最好,可將果實(shí)的抗氧化活性由28.0～30.9 mmol·g-1提升至31.8～38.1 mmol·g-1。Bowen-Forbes等［45］以黑莓和草莓為試驗(yàn)對象,研究了果實(shí)的花色苷組成,抗氧化活性及抗癌性能等。結(jié)果顯示,黑莓與草莓果實(shí)中均含豐富的花色苷物質(zhì),每100 g鮮果含146～2 199 mg花色苷,具有很強(qiáng)的抗氧化能力,所提取出的花色苷在50μg·m L-1時(shí)能抑制50%以上的油脂過氧化反應(yīng),很好地維持果實(shí)品質(zhì)。

黑莓具有調(diào)節(jié)代謝機(jī)能、延緩衰老、消除疲勞和提高免疫力等作用［46］；同時(shí)黑莓花色苷還具有抗突變及抗腫瘤的作用。此外,研究發(fā)現(xiàn),花色苷能夠抑制癌細(xì)胞生長,另外還具有抑制胃潰瘍、延遲血小板凝集、提高視力、改善微循環(huán)等功能［47］,被譽(yù)為 “紫色生命果”。不同產(chǎn)地黑莓的不同溶劑提取物抑制COX-2表達(dá)的作用也不同,其中黑覆盆子的抑制效果最強(qiáng),達(dá)7 l%,成分分析表明起作用的主要是花色苷類化合物［48］。以矢車菊色素-3-O-葡萄糖苷等花色苷為主的黑莓提取物能抑制人體結(jié)腸直腸癌細(xì)胞HT-29、乳腺癌細(xì)胞MCF-7及血癌細(xì)胞HL-60的生長,其中對HT-29細(xì)胞的抑制效果最為明顯,且抑制效果與濃度呈依賴關(guān)系,黑莓提取物的這種抗癌作用可能與其活性成分刺激細(xì)胞產(chǎn)生ROS而殺死細(xì)胞有關(guān)［49］。Bowen-Forbes等［45］發(fā)現(xiàn)花色苷濃度為50μg·m L-1時(shí)能有效控制油脂過氧化反應(yīng),對腸癌、乳房癌、胃癌和肺癌的抑制率分別能達(dá)到50%,24%,37%和54%。越來越多的研究表明,黑莓花色苷能提高人體的抗氧化應(yīng)激能力,從而實(shí)現(xiàn)對人體的保護(hù)作用,然而目前黑莓藥用價(jià)值方面的開發(fā)較少,仍有待進(jìn)一步的深入研究。

5 總結(jié)與展望

目前,評價(jià)和篩選功能性天然色素已成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和食品科學(xué)研究的新熱點(diǎn)。花色苷類色素不僅是一種安全可靠的天然食用色素,而且由于其特殊的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì),可抑制自由基產(chǎn)生、清除自由基、中斷自由基反應(yīng)鏈,在機(jī)體內(nèi)不同的微環(huán)境和代謝生化反應(yīng)鏈中起到抗氧化作用,有助人類健康,因此受到食品、藥品和化妝品等行業(yè)和青睞,引起學(xué)者的廣泛關(guān)注。

雖然各國學(xué)者對黑莓花色苷的研究取得了一定的成就,但目前研究較多的單一提取、純化方法利弊不一,提取效率仍較低,不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求。因此,研究開發(fā)新型高效的黑莓花色苷提取、分離純化技術(shù),最終實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)顯得尤其重要。黑莓花色苷被譽(yù)為 “紫色生命果”,然而其在食品行業(yè)中的研究還較少,今后可重點(diǎn)開發(fā)相關(guān)飲料、酒類及果醬等,增加產(chǎn)品的附加值。目前,雖然研究發(fā)現(xiàn)花色苷具有很強(qiáng)的抗氧化、抗衰老和抗癌功能,但是其生理功能的作用機(jī)制尚未明晰。而且目前大多數(shù)抗氧化研究均以體外清除自由基效果評價(jià)為主,難以全面體現(xiàn)其抗氧化作用的生物學(xué)意義,因此需加強(qiáng)相關(guān)機(jī)理的研究。對于花色苷的抗氧化特性,可通過健康群體和高危群體進(jìn)行長期人體研究,調(diào)查黑莓花色苷預(yù)防慢性疾病的作用,研究確定黑莓花色苷的安全、可容忍和預(yù)防疾病的攝入量,為保健藥品開發(fā)提供依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：高 峻）

S 663.2

：A

：0528-9017（2014）04-0550-05

文獻(xiàn)著錄格式：徐龍,葛林梅,郜海燕,等.黑莓花色苷提取純化及抗氧化研究進(jìn)展 ［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2014（4）：550-554.

2014-01-15

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目 （2012BAD38B05）；國家公益性行業(yè) （農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng) （201303073）

徐 龍 （1988-）,男,碩士研究生,江西上饒人,研究方向?yàn)槭称肺锪髋c質(zhì)量控制。E-mail：xu long0213@163.com。

郜海燕 （1958-）,女,浙江杭州人,研究員,博士生導(dǎo)師,研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。E-mail：spshy@163.com。