李愛麗 趙 欣 趙麗麗 韓英博 姚建華 王彥紅 王思鑒

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春 130041 )

隨著飲食結(jié)構(gòu)的變化和生活水平的提高，腦梗死的發(fā)病率呈越來越高、越來越年輕化趨勢。腦梗死病因較多，除動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病、心臟病、高血脂、吸煙及飲酒等因素外，有學(xué)者認(rèn)為其發(fā)病可能與載脂蛋白E(ApoE)基因多態(tài)性有關(guān)。AopE是血脂的重要組成部分，其基因多態(tài)性與種族、地域、環(huán)境等因素有關(guān)。本文通過檢測400例吉林省漢族腦梗死患者AopE的基因多態(tài)性以揭示其與腦梗死的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1對象 研究組為2010年12月至2013年10月在吉林大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科和長春市中醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的漢族腦梗死患者400例，其中男246例，女154例，平均年齡(60. 08±10. 25)歲；入選標(biāo)準(zhǔn)：符合1995年全國第4屆腦血管病學(xué)術(shù)會議的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且均經(jīng)頭部CT或MRI確診，排除動脈炎、脂肪栓塞、藥物、腫瘤等引起的腦梗死。對照組為同期在吉林大學(xué)第二醫(yī)院體檢中心健康體檢者，隨機(jī)抽取漢族100例，其中男57例，女43例，平均年齡(61.59±9.72)歲，入選標(biāo)準(zhǔn)：排除阿爾茨海默病、腦血管病、糖尿病、心臟病、肝腎疾病、血液疾病等。兩組的年齡、性別比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本收集 抽取空腹患者及對照者肘靜脈血10 ml，血中加入乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na)抗凝，-20℃冰箱保存，待血液樣本收集完成后統(tǒng)一測定。

1.2.2基因組DNA提取 采用血液基因組DNA提取盒從血液白細(xì)胞中提取DNA。

1.2.3PCR擴(kuò)增 引物序列(由上海生工生物技術(shù)公司合成)為：P1(正義)：5′-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3′；P2(反義)：5′-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3′。PCR反應(yīng)體系：總體系20 μl，基因組DNA 2 μl，2倍緩沖液10 μl，DNA 聚合酶0.4 μl，正義及反義引物各6 pmol(1.2 μl)，無菌雙蒸水6.4 μl。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，然后95℃變性60 s、62℃退火45 s，最后72℃延伸60 s，共30個循環(huán)，最后72℃進(jìn)一步延伸7 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)含有EB的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.4PCR產(chǎn)物酶切 總體積20 μl，PCR產(chǎn)物8 μl，HhaI內(nèi)切酶1 μl，2倍緩沖液2 μl(大連寶生物公司)，無菌蒸餾水9 μl，混勻，37℃溫浴2 h。反應(yīng)終止后產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，EB溶液染色后觀察結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析。等位基因頻數(shù)計(jì)算采用平均法。基因型和等位基因頻率計(jì)算方法：基因型頻率=基因型頻數(shù)/總例數(shù)；等位基因頻率=(純合子基因型頻率+雜合子基因型頻率)/2。組間基因型及等位基因頻率的比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1腦梗死組與對照組ApoE基因型的比較 腦梗死組ApoE 6種基因型的頻率分別為：ε2/2 0.5%、ε3/3 67%、ε4/4 8%、ε2/3 6.5%、ε2/4 7.8%、ε3/4 10.2%；對照組為ε2/2 2%、ε3/3 79%、ε4/4 4%、ε2/3 7%、ε2/4 3%、ε3/4 5%。兩組均以ε3/3基因型的頻率最高，并且對照組明顯高于腦梗死組(P<0.05)；腦梗死組以ε4/4及ε3/4基因型頻率次之，但與對照組無差異(P>0.05)。

2.2腦梗死組與對照組等位基因的比較 腦梗死組ApoE 3種等位基因的頻率分別為ε2 6%、ε3 75%和ε4 19%，對照組分別為ε2 7%、ε3 85%、和ε4 8%。兩組中均以ε3等位基因頻率最高，且對照組明顯高于腦梗死組(P<0.05)，ε4等位基因頻率次之，且腦梗死組也明顯高于對照組(P<0.05)，ε2等位基因頻率最低，兩組間差異不顯著(P>0.05)。

3 討 論

ApoE是一種含有299個氨基酸結(jié)合有磷脂的單鏈多糖蛋白，其分子量為34 kDa，含有4個外顯子及3個內(nèi)含子，ApoE基因具有多態(tài)性，有3種等位基因ε2、ε3和ε4，因此人群中共有6種ApoE的基因型，即三種純合子ε2/2 、ε3/3 、ε4/4，及三種雜合子ε3/2 、ε2/4 及ε3/4。其中最常見的基因型是ε3/3，最常見的等位基因?yàn)棣?，ε2及ε4較少。ε3被認(rèn)為是“野生型”，ε2及ε4被認(rèn)為是由ε3變異而來。ApoE參與機(jī)體血脂代謝及調(diào)節(jié)膽固醇平衡，在動脈硬化性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用。本研究結(jié)果表明ε3/3基因型及ε3等位基因可能是腦梗死的保護(hù)因素，而ε4等位基因可能是腦梗死的危險因素，這與國內(nèi)的一些學(xué)者研究一致。王秀娟等〔1〕研究認(rèn)為ε3 等位基因具有保護(hù)作用，而ε4 等位基因可能是腦梗死的危險因素。姜長春等〔2〕研究發(fā)現(xiàn)腦梗死組ApoEε3/4基因型和ε4等位基因組較對照組升高，提示ε4等位基因是腦梗死的遺傳易患因子，而ε3等位基因具有保護(hù)作用。張波等〔3〕研究認(rèn)為ε3/3基因型、ε3等位基因可能是腦梗死的保護(hù)因素，ε4等位基因是腦梗死的危險因素。而對于ε3、ε4等位基因與腦梗死的關(guān)系研究結(jié)果也不一致，盧紅艷等〔4〕研究認(rèn)為ApoEε4 是動脈粥樣硬化性血栓形成的遺傳易感因子，未發(fā)現(xiàn)ε3等位基因?qū)δX梗死的保護(hù)作用。周正艷等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)腦梗死組ε3/4基因型、ε4等位基因頻率明顯高于對照組，認(rèn)為ε4是黎族腦梗死的一種遺傳易感因子；Jin等〔6〕研究亦認(rèn)為ε4為腦梗死的遺傳易感因子，未發(fā)現(xiàn)ε3等位基因的保護(hù)作用。趙志全等〔7〕研究認(rèn)為ε3/4基因型可能是腦梗死病人腦動脈粥樣硬化的危險因素，尚不能明確ε3、ε4等位基因與腦梗死的關(guān)系。有學(xué)者對轉(zhuǎn)基因鼠缺血性腦梗死的研究發(fā)現(xiàn)，攜ε4等位基因者較攜ε3者病灶大，病情重〔8〕。對此有些可能的解釋如下：(1)ε3等位基因有助于神經(jīng)生長〔9〕；(2)ε3等位基因較ε4有更強(qiáng)的抗氧化作用〔10〕；(3)ε4等位基因能增加β-淀粉樣蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)的沉積，進(jìn)而影響神經(jīng)元〔11〕。

關(guān)于ε2等位基因與腦梗死的關(guān)系有些學(xué)者研究不一致，Anuurad等〔12〕認(rèn)為攜帶ε4和ε2 基因型的人群發(fā)生缺血性腦卒中事件的發(fā)病危險均呈上升變化。然而，王永卿等〔13〕研究認(rèn)為ε2/ 2對腦梗死可能具有保護(hù)作用。Kokubo等〔14〕認(rèn)為腦卒中與ApoE基因多態(tài)性的關(guān)系存在爭議可能是腦卒中分類不明確和年齡的劃分不同所致，研究認(rèn)為ε2是血栓形成和心源性栓塞的危險因素，ε2與腦卒中的關(guān)系在>70歲的人中減弱，年齡和ApoE基因多態(tài)性可能均影響腦卒中的發(fā)生。

綜上所述，人們對ApoE與腦梗死的關(guān)系越來越高度重視，研究結(jié)果的某些不一致，可能與研究樣本的大小、種族、年齡及飲食習(xí)慣等因素有關(guān)，這有待于更大樣本的臨床研究證實(shí)。相信隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展這個問題將會更加明確，從而將有助于腦梗死的早期防治。

4 參考文獻(xiàn)

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2姜長春，孫洪英，和姬苓，等.腦血管病患者載脂蛋白E基因多態(tài)性分析〔J〕.中國卒中雜志，2008；3(3)：181-5.

3張 波，張卓伯，劉 洪，等.載脂蛋白E基因多態(tài)性與腦梗塞的關(guān)聯(lián)研究〔J〕.華西醫(yī)學(xué)，2006；21(1)；90-1.

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13王永卿，吳嬋娟，姚 敏，等.黎族心腦血管疾病患者Apo E基因多態(tài)性分析〔J〕.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2012；27(4)：308-15.

14Kokubo Y，Chowdhury AH，Date C，etal. Age-dependent association of apolipoprotein E genotypes with stroke subtypes in a Japanese rural population〔J〕.Stroke,2009;31(6):1299-306.