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（銅川市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，陜西銅川 727031）

具有免疫作用的多殺性巴氏桿菌外膜蛋白特性研究

田 亮，穆 秦，岳 登，付塞琴

（銅川市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，陜西銅川 727031）

外膜蛋白是細胞膜的重要成分之一，在免疫方面的作用日益受到關注，對其深入研究可使開發(fā)有效的多殺性巴氏桿菌外膜蛋白疫苗成為可能，本文就多殺性巴氏桿菌概況、組成及具有免疫作用的外膜蛋白的特性進行綜述，以期推動多殺性巴氏桿菌疾病的診斷和防治。

多殺性巴氏桿菌；外膜蛋白；免疫作用；研究

巴氏桿菌病致病菌主要包括多殺性巴氏桿菌（Pasteurellosis multocida，Pm）、溶血性巴氏桿菌和嗜肺性巴氏桿菌等，其中以多殺性巴氏桿菌存在較為普遍，該菌主要致使動物發(fā)生出血性敗血病或傳染性肺炎。目前所使用的疫苗在一定程度上對多殺性巴氏桿菌病的防治起到了一定的作用，但因多殺性巴氏桿菌的血清型較多（16種不同血清型）、疫苗的免疫譜窄（只對同型菌株的強毒攻擊具有較好的保護）和保護期較短及抗菌藥物效果不穩(wěn)定（易產(chǎn)生耐藥性）等原因，導致本病至今仍未能得到有效的控制。因此，研制安全且有交叉免疫保護性的亞單位疫苗來預防牛巴氏桿菌病是亟待解決的問題。膜蛋白是革蘭陰性菌表面的成分，也是多殺性巴氏桿菌的一類重要的毒力因子。近年來，外膜蛋白在免疫學方面的作用越來越受到關注，隨著對Pm外膜蛋白的深入研究，開發(fā)有效的多殺性巴氏桿菌外膜蛋白疫苗成為一種可能。

1 多殺性巴氏桿菌簡介

多殺性巴氏桿菌有4個亞種，分別為多殺亞種、敗血亞種、殺禽亞種和tigris亞種[1]。Pm主要以其莢膜抗原菌體抗原區(qū)分血清型，前者有6個型，后者分為16個型。外膜蛋白（outer membrane proteins OMPs）能夠從不同程度上表現(xiàn)不同菌株間的變化，這可以用來評定菌株間的差異，從而確定流行病學關聯(lián)性。目前Pm已經(jīng)有多種外膜蛋白被檢測、克隆并命名，主要有OmpH蛋白、OmpA蛋白、Oma87蛋白、PlpB蛋白、鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白等，并且有大量的研究證實多殺性巴氏桿菌的外膜蛋白可作為免疫原，對機體產(chǎn)生免疫保護作用，也可作為快速診斷試劑盒。這為多殺性巴氏桿菌外膜蛋白疫苗的研制奠定了基礎。

2 外膜蛋白的定義及組成

OMPs是存在于細菌外膜之中的以及與外膜有關的所有蛋白質(zhì)的總稱，是革蘭陰性菌外膜的主要結(jié)構(gòu)成分，在細菌包漿膜（內(nèi)膜）和肽聚糖層外側(cè)包圍著整個細菌，其厚度為8-10nm，約占細胞壁干重的80%，是典型的非對稱性磷脂雙層結(jié)構(gòu)，外膜蛋白按其在細胞中的拷貝數(shù)高低分為主要蛋白和微量蛋白。主要蛋白包括外膜蛋白H（outer membrane ptotein H，OmpH）、外膜A蛋白（outer membrane protein A，OmpA）、微孔蛋白（Porins）、脂蛋白（Lipoprotein，Lpp）等。

3 具有免疫作用的外膜蛋白的特性

3.1 OmpH蛋白

OmpH是Pm菌體最主要的外膜蛋白之一，它是一種孔道形成蛋白，暴露于菌體表面，屬于非特異性細菌外膜脂蛋白超家族。其分子質(zhì)量一般為32～39 KDa，具有一般孔蛋白的特性，能夠誘導高水平的保護性抗體。OmpH 蛋白也是Pm的一種主要的保護性抗原，免疫保護試驗結(jié)果表明，OmpH蛋白能夠?qū)ν淳a(chǎn)生保護力[2]。

有研究人員認為外膜蛋白H（OmpH）是疫苗的理想候選者，能以高拷貝數(shù)表達，位于菌體表面并且具有免疫原性。Pm不同的血清型的該蛋白具有很高的同源性，有兩個不連續(xù)的超變區(qū)與機體免疫系統(tǒng)相互作用。Luo等[3]研究表明：純化的天然ompH能誘導100%的保護率，與全菌誘導的保護率相當，但重組的ompH不具有保護性。曹素芳等[4]用成熟外膜蛋白H重組亞單位疫苗免疫雞，能夠誘導雞體產(chǎn)生較高的特異性抗體，其抗體水平明顯高于禽Pm弱毒疫苗組和對照組。Tan H Y等[5]研究表明重組PmOmpH蛋白腹腔注射免疫小鼠其對Pm入侵保護率達100%，于此同時皮下注射保護率可達80%。表明重組OmpH蛋白能夠作為疫苗合適的候選基因，并且為建立ELISA快速診斷試劑盒提供了可能。

3.2 OmpA蛋白

OmpA 蛋白屬跨膜蛋白，又稱修飾蛋白，具有熱修飾性，該蛋白經(jīng)SDS加熱后進行SDS-PAGE電泳時，其涌動速度明顯減慢。有研究表明，該蛋白除了具有維持外膜結(jié)構(gòu)的作用外，主要是在細菌感染早期與細胞基質(zhì)相互作用，定植于宿主細胞。外膜蛋白A序列具有很高的保守性，良好的免疫原性，可刺激細胞免疫和體液免疫[6]。據(jù)報道，重組的Omp A 蛋白能夠引起強烈的Th2 類型的免疫反應，能夠產(chǎn)生較高水平的IgG 抗體等特點。研究表明，牦牛源Pm的重組OmpA的保護性達40%，保護性低于全菌滅活組的80%[7]。

3.3 PlpB蛋白

2001年PlpB蛋白被提純，并證實其與血清間的交叉保護有關，而且發(fā)現(xiàn)該蛋白位于Pm細胞的表面或外圍。王紅勛等[8]首次將PlpB基因克隆到融合表達載體pGEX-KG中，并用瓊脂雙向擴散試驗檢測血清抗體效價。結(jié)果表明，所構(gòu)建的原核表達重組質(zhì)粒pKG-plpB在大腸桿菌BL21融合表達的蛋白plpB能誘導小鼠產(chǎn)生免疫反應，可保護小鼠抵抗強毒的攻擊，這種免疫保護作用也可通過血清被動傳遞給非免疫小鼠，使后者獲得對強毒的抵抗力。

3.4 鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白

限鐵條件迫使細菌產(chǎn)生高親合性的攝鐵系統(tǒng)，主要有轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（Tbpn），乳鐵蛋白受體（Lbp）、血晶素/血紅素錨定蛋白受體（HgbMB）及亞鐵血紅素獲得系統(tǒng)受體（HasR）等，其與宿主競爭攝取鐵離子復合物，從而獲取鐵滿足自身代謝需要，這類蛋白屬于外膜蛋白家族。它們僅在限鐵條件下表達，故被稱之為鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白（IROMPs）。顧宏偉等[9]用間接ELISA法分別定量分析了兔源PmCSI-17的99kD IROMPs交叉抗體滴度，結(jié)果表明：該蛋白在不同的菌株之間存在良好的抗原交叉性，從而推測該IROMPs為重要的保護性抗原。Prado ME等[10]給牛注射了Pm232活菌苗或者鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白，都能夠產(chǎn)生很強的免疫應答反應。表明IROMPs是Pm的主要抗原基因之一。

3.5 其他外膜蛋白

除了以上具有免疫作用的外膜蛋白外，Kasten等[11]分離、鑒定了P6樣外膜蛋白蛋白具有抗原性；Ruffolo 等在大腸桿菌中成功表達的重組Oma87產(chǎn)生的抗血清能夠?qū)π∈螽a(chǎn)生免疫保護作用；Bisweswar等[12]發(fā)現(xiàn)用純化重組OmpW蛋白的抗血清可保護乳鼠免受霍亂弧菌活菌的攻擊。因此推測Pm OmpW的重組蛋白也能夠抵抗Pm的攻擊。

4 展望

多殺性巴氏桿菌Omps具有良好的免疫原性，不僅可激發(fā)機體的體液免疫，而且可引起細胞免疫，并且還可通過遺傳工程技術大量表達，這一結(jié)論已經(jīng)得到證實。然而，多殺性巴氏桿菌重組OmpH、OmpA等單一抗原基因的疫苗免疫性還沒有一致的結(jié)論，這可能使由于單一的抗原基因可能不足以產(chǎn)生抵抗強度攻擊的保護力。因此，可以以OMPs型為依據(jù)，選擇優(yōu)勢免疫保護抗原或構(gòu)建多價融合性OMPs菌株，或許能夠解決單一抗原基因免疫效果不佳及全菌滅活苗等傳統(tǒng)疫苗免疫譜窄，存在安全隱患等問題，必將會大大推動多殺性巴氏桿菌疾病的防治和診斷。

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Studies on the Features of Outer Membrane Protein with Immune Action of Pasteurella multocida

Tian Liang，Mu Qin，Yue Deng，F(xiàn)u Saiqin
（Tongchuan City Animal Health Supervision Institute，Tongchuan，Shaanxi 727031）

Outer membrane protein is an important component of cell membranes，and its immune role is attracting much concern. The development of effective Pasteurella multocida outer membrane protein vaccine is possible due to deepening its study. In this paper，Pasteurella multocida profle，composition and outer membrane proteins with immune action were reviewed in order to promote the prevention and diagnosis of Pasteurella multocida disease.

Pasteurella multocida；outer membrane protein；immune action；research

文獻標識碼：B

：1005-944X（2014）08-0029-03