劉世海 鄭海萍 鄧 旭 張紅兵 林紹儀 (佛山市順德區(qū)樂從醫(yī)院骨科，廣東 佛山 528315)

骨關(guān)節(jié)炎(OA)臨床癥狀表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛，慢性功能受損，嚴(yán)重影響了中老年人的生活質(zhì)量。如何早期診斷、預(yù)防和治療OA成為臨床醫(yī)生近年研究的熱點(diǎn)也是重點(diǎn)。由于早期診斷缺乏特異性，因此學(xué)者尋求關(guān)節(jié)軟骨新陳代謝所釋放的生物學(xué)標(biāo)記物間接判斷OA軟骨病變的程度、預(yù)后和評(píng)價(jià)療效。本研究我們采用原子力顯微鏡(AFM)探針修飾上軟骨寡基質(zhì)蛋白(COMP)抗體，探測(cè)早期膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)患者以及KOA高危人群血清紅細(xì)胞膜COMP抗原之間的相互作用力，研究OA亞臨床期與早期病變程度與血清紅細(xì)胞膜上COMP引發(fā)的細(xì)胞力學(xué)特性改變之間的關(guān)系，探討COMP在OA早期發(fā)病中所起的作用及AFM用于臨床上早期診斷KOA發(fā)病的可能性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對(duì)象為2005年1月至2012年6月在我院骨科治療的早期KOA患者62例。其中男性22例，平均年齡(52.45±9.34)歲;女性 40例，平均年齡(60.26±10.12)歲。KOA的診斷依據(jù)美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)院膝骨性關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)〔1〕將所攝X線片將KOA分為6級(jí)。其中早期OA的X線為1級(jí)。早期OA組在門診行口服藥物治療。有膝關(guān)節(jié)酸痛，伴有膝關(guān)節(jié)腫脹，活動(dòng)后疼痛緩解，無(wú)X線改變的KOA高危人群12例。其中男性4例，平均年齡(45.86±7.48)歲;女性8例，平均年齡(49.48±8.05)歲。隨訪3年，發(fā)現(xiàn)9例轉(zhuǎn)歸為KOA早期患者，3例未出現(xiàn)病變并入正常對(duì)照組。所有病例均排除肝腎疾病、內(nèi)分泌疾病、嚴(yán)重的心血管疾病及腫瘤疾病患者。正常對(duì)照組5例，均為女性，平均年齡(51.47±8.70)歲，均無(wú)膝痛病史，X線片未見有膝關(guān)節(jié)病變。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 所有受試對(duì)象空腹抽取靜脈血2 ml。離心后取上清液置－70℃保存待測(cè)。

1.2.2 采用ELISA法檢測(cè)血清COMP水平 所有樣本均用PBS緩沖液5倍稀釋，吸取50 μl樣品、已稀釋樣品和質(zhì)控品分別至每孔，加入50 μl已稀釋的酶標(biāo)抗體后，室溫孵育2 h，洗板6次，拍干液體后，加50 μl的親和素-HRP，再次孵育15 min，洗板3次后每孔加入酶基質(zhì)TMB，孵育15 min。加100 μl H2SO4中止反應(yīng)，酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光度值。根據(jù)標(biāo)本的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出COMP的濃度。

1.2.3 紅細(xì)胞標(biāo)本的制備 受試對(duì)象均空腹12 h以上，于清晨采集外周靜脈血 2 ml。肝素鋰抗凝，1 000 r/min離心10 min，PBS緩沖液重懸并洗滌除去血漿和棕黃色血膜層，最后用PBS重懸并稀釋，少量滴于蓋玻片上。2.5%戊二醛固定20 min，三蒸水緩慢沖洗除去戊二醛和鹽分，風(fēng)干待用。

1.2.4 AFM針尖修飾 將浸泡在丙酮中的AFM標(biāo)準(zhǔn)針尖用紫外光照射去除針尖上的雜質(zhì)，然后將針尖浸于生物素化的牛血清白蛋白溶液中，室溫放置過夜，PBS反復(fù)沖洗，再將針尖浸泡在50 μl鏈霉親和素中，室溫下放置1 h，PBS再次沖洗。最后將針尖浸泡在100 nmol/l的生物素化的COMP單克隆抗體溶液中4℃反應(yīng)過夜，取出后再用PBS沖洗，就可得到Bio抗人COMP單克隆抗體修飾的針尖。在AFM力譜測(cè)量實(shí)驗(yàn)中可直接使用制備好的針尖。

1.2.5 AFM的樣品制備、成像 將制備好的樣品固定在AFM的XY掃描臺(tái)上，用監(jiān)視器定位所要掃描的樣品區(qū)域，在空氣中室溫下利用接觸模式成像。采用100 μm掃描器，UL20B硅探針，力常數(shù)為2.8 N/m，AFM圖像經(jīng)自帶軟件平滑處理，以消除掃描方向上的低頻背景噪音。利用AFM力位移曲線測(cè)量系統(tǒng)在同一loading rate下測(cè)量得到力的曲線進(jìn)行力的統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用成組t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。采用One-way ANOVA分析方法比較三組紅細(xì)胞黏附力和硬度。數(shù)據(jù)以s表示。

2 結(jié)果

2.1 三組血清COMP含量的比較 KOA高危組血清中COMP含量〔(7.83±2.27)pg/ml〕與正常組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔(6.06±1.65)pg/ml，P＞0.05〕。KOA 早期患病組血清中COMP含量〔(12.35±3.74)pg/ml〕均顯著高于正常組及KOA高危組(P＜0.05)。

2.2 三組紅細(xì)胞力學(xué)特性的比較 對(duì)三組細(xì)胞力學(xué)性能進(jìn)行研究，KOA早期患病組、KOA高危組與正常組紅細(xì)胞COMP抗原抗體間特異性黏附力之間相互比較差異顯著(P＜0.05)。正常組的黏附力為(202±32)pN，KOA高危組黏附力為(313±39)pN，明顯高于正常組。而 KOA早期患病組為(510±57)pN，比上述兩組均高。正常組、KOA高危組、KOA早期患病組彈性模量分別為(1.53±0.23)、(2.19±0.33)、(2.85±0.45)kPa，三組彈性模量相互比較也均有顯著性差異(P＜0.05)。KOA早期患病組明顯高于其他兩組。

3 討論

通常KOA的診斷主要依據(jù)病人的主觀主訴，如關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)障礙等，結(jié)構(gòu)的測(cè)量，如膝關(guān)節(jié)X線、MRI以及通過關(guān)節(jié)軟骨新陳代謝所釋放的一些生物標(biāo)記物的檢測(cè)。X線、MRI是傳統(tǒng)的也是常用的KOA診斷方法，它們同時(shí)可以預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展和指導(dǎo)治療。但X線不像骨疾病診斷那么直觀，對(duì)于OA它只是提供了間接的病理學(xué)信息，例如關(guān)節(jié)間隙變窄，骨侵蝕、骨贅形成、骨硬化或骨量減少以及軟組織腫脹等。而且對(duì)于KOA疾病發(fā)生的早期X線征象不明顯，X線與患者關(guān)節(jié)功能改變的相關(guān)性不大〔2〕。所以尋求生物學(xué)標(biāo)記物，例如軟骨來(lái)源的分子或肽片段，對(duì)于OA早期診斷、OA有效防治及疾病嚴(yán)重性評(píng)估就顯得尤為重要及迫切。這些標(biāo)記物的生化檢測(cè)相對(duì)于X線和MRI，可以提高OA診斷的準(zhǔn)確性和敏感性，減少患者費(fèi)用〔3〕。但我們同時(shí)更要考慮到早期診斷的特異性。

OA潛在的生物標(biāo)記物包括小型元件、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、蛋白酶、蛋白酶抑制劑、針對(duì)軟骨組分的血清自體抗體〔2〕。其中COMP是一種細(xì)胞外鈣結(jié)合蛋白，屬于血小板反應(yīng)蛋白家族〔4〕。雖然它的特定功能仍不明確，但它通過與膠原纖維及基質(zhì)成分的交互作用，組裝及穩(wěn)定軟骨細(xì)胞外基質(zhì)，具有軟骨組織特異性〔5，6〕。軟骨損傷發(fā)生后，COMP最先釋放進(jìn)入關(guān)節(jié)液中，隨后擴(kuò)散進(jìn)入血液中，通過尿液排泄〔7〕。所以關(guān)節(jié)液和血清中COMP水平可以反映關(guān)節(jié)軟骨的損害程度和炎癥程度〔8，9〕。

既往研究表明，OA患者關(guān)節(jié)液COMP水平明顯高于正常對(duì)照組。Clark等〔10〕報(bào)道KOA患者血清COMP水平明顯高于對(duì)照組。Vilim等〔11〕認(rèn)為血清COMP水平與關(guān)節(jié)間隙改變相關(guān)。Sharif等〔12〕進(jìn)一步研究闡明COMP水平與KOA關(guān)節(jié)損害進(jìn)展相關(guān)。以上研究表明COMP可以作為關(guān)節(jié)退變的一種檢測(cè)手段，血清或關(guān)節(jié)液COMP的檢測(cè)能提高OA診斷的準(zhǔn)確性〔13〕。但傳統(tǒng)的研究認(rèn)為COMP水平只適合血清檢測(cè)，因?yàn)殛P(guān)節(jié)液由于透明質(zhì)酸和蛋白成分的存在導(dǎo)致了高黏滯性，增大了分析難度。而且我們回顧上述文獻(xiàn)研究報(bào)道并未發(fā)現(xiàn)血清COMP在OA早期診斷中的提示作用，研究者關(guān)注的是血清COMP在OA早、中、晚期患者疾病預(yù)判上的效果。其實(shí)對(duì)于OA高危人群，我們更應(yīng)該關(guān)注，如果能及早發(fā)現(xiàn)這類人群的轉(zhuǎn)歸，對(duì)于盡早采取防治措施和指導(dǎo)早期治療意義重大。

本研究說明血清COMP檢測(cè)無(wú)法區(qū)別OA高危人群與正常人群，無(wú)法早期預(yù)判OA的發(fā)生，不具備早期診斷OA的條件。運(yùn)用AFM探針修飾上COMP抗體檢測(cè)與紅細(xì)胞膜上COMP抗原間相互作用力，這種方法能找出OA高危人群，及時(shí)預(yù)判這類人群的轉(zhuǎn)歸，及早指導(dǎo)及預(yù)防或延緩OA的進(jìn)展，為尋求藥物治療這類人群提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和數(shù)據(jù)。

疾病發(fā)生必然伴有細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能改變，臨床上的一些檢測(cè)都只是從宏觀角度觀察和認(rèn)識(shí)疾病的進(jìn)程，無(wú)法獲得微觀的信息，而這些無(wú)法用肉眼看見的微觀變化正是功能改變的關(guān)鍵性因素。本研究我們采用納米技術(shù)在微觀領(lǐng)域上探討OA高危人群與正常對(duì)照人群紅細(xì)胞膜上COMP抗原抗體作用力，發(fā)現(xiàn)兩組間有顯著性差異，說明我們可以運(yùn)用AFM修飾上COMP抗體進(jìn)行OA初篩。紅細(xì)胞容易獲取，患者易接受并配合檢查，故這種方法值得廣泛推廣。只是AFM暫時(shí)仍作為科研設(shè)備未普遍進(jìn)入臨床中使用，本試驗(yàn)我們正是和暨南大學(xué)測(cè)試中心合作完成。但我們相信在不久的未來(lái)，將建立高校與基層醫(yī)院的合作體系，標(biāo)本檢測(cè)更迅捷、方便。畢竟這項(xiàng)檢測(cè)的開展有利于早期預(yù)知OA。

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