張慶華，徐彥召，王 青，趙志雨，尚田田，胡建和

（河南科技學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)453003）

目前細菌耐藥問題的日益嚴(yán)重，如超級細菌的產(chǎn)生，以及動植物食品的藥物殘留問題，給人類的健康安全產(chǎn)生重大的威脅。而在過去的幾個世紀(jì)，新型抗菌藥物的研發(fā)進展一直進展緩慢。因此人們急需一種抗菌活性高、安全、不易產(chǎn)生耐藥性的新型抗菌藥物。在尋找抗生素替代藥物的過程中，人們逐漸把眼光投向了抗菌肽。

抗菌肽（Antimicrobial Peptides，AMPs）是生物在長期進化過程中保留下來的古老而又有效的天然免疫重要活性分子，參與機體的第一道免疫防線，是機體先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分[1]。抗菌肽在自然界中廣泛存在細菌、病毒、植物、動物包括人體內(nèi)?？咕膶Ω锾m陽性菌和陰性菌、病毒、癌細胞，包括多重耐藥菌及HIV病毒都有抑制作用[2-3]。且有實驗表明，抗菌肽用于外傷感染時既可抑制細菌感染又能促進傷口的愈合[4]。由于抗菌肽具有高效抗菌、無殘留、不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點，是目前國際公認的抗生素最佳替代品。

然而，天然抗菌肽也并非是完美的，大部分的天然抗菌肽抑菌活性并不高，且在發(fā)揮抑菌效果的同時，往往對正常的真核細胞也產(chǎn)生毒性，以及溶血作用，這都限制了抗菌肽的發(fā)展應(yīng)用。因此，目前對抗菌肽的研究重點在于，通過對人工設(shè)計的一系列不同抗菌肽類似物的研究，探明其抑菌、細胞毒性、溶血活性的機制，從而為獲得抑菌活性高，對正常真核細胞低毒甚至無毒性、無溶血性，高效、安全的抗菌肽奠定理論基礎(chǔ)。

到目前為止發(fā)現(xiàn)的抗菌肽已有2 000多種。已測定了幾百種不同抗菌肽的氨基酸序列，這些抗菌肽在長度、結(jié)構(gòu)、序列上各有明顯的不同，抗菌肽大多由20～40個氨基酸殘基組成，且其一級結(jié)構(gòu)具有明顯的特征，即肽鏈中間富含脯氨酸（Pro），C端富含Gly、Val和Ala等非極性氨基酸，而N端多含精氨酸（Arg）、賴氨酸（Lys）等極性的氨基酸[5]。因此他們都表現(xiàn)兩個共同的特征：陽離子肽；活性結(jié)構(gòu)為兩親性。目前對抗菌肽的作用機理還沒有統(tǒng)一的認識，但是大多數(shù)的理論都認為其作用機制與其陽離子性和疏水性有關(guān)。因此，為了獲得安全、高效的抗菌肽，目前對抗菌肽的結(jié)構(gòu)功能研究以及分子設(shè)計主要是圍繞改變其離子性和疏水性進行。

1 抗菌肽的結(jié)構(gòu)分類

在Boman發(fā)現(xiàn)抗菌肽后，最初根據(jù)結(jié)構(gòu)，將抗菌肽分為如下5類：

（1）具有α-螺旋結(jié)構(gòu)的線性抗菌肽。不含Cys，目前此類成員最多，天蠶素（Cecropins）、滑瓜蟾素（Magainins）屬于此類。

α-螺旋是一種具有水脂兩親性的結(jié)構(gòu)，存在于多種蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)中，許多膜蛋白、信號肽以及具有膜識別功能的蛋白質(zhì)中都含有此結(jié)構(gòu)，是抗菌肽裂解細菌膜的重要活性區(qū)域。

Cecropin是第一個被發(fā)現(xiàn)的天然抗菌肽的研究者，此后人們陸續(xù)從家蠶、果蠅、柞蠶、麻蠅中分離得到cecropin類抗菌肽，這類多肽一般含有37～39個氨基酸殘基，不含Cys，其C端區(qū)域可形成疏水性的螺旋結(jié)構(gòu)，N端區(qū)域具有較強的堿性，可形成典型的雙親性螺旋結(jié)構(gòu)，兩者之間存在由脯氨酸和甘氨酸形成的鉸鏈區(qū)。且多數(shù)肽的C端被酰胺化，研究表明酰胺化對其抗菌活性具有重要作用。

Magainins也是最初從蟾蜍的皮膚中分離得到的一種具有雙親螺旋結(jié)構(gòu)的抗菌肽，后來在哺乳動物的神經(jīng)組織和腸道組織中發(fā)現(xiàn)了其類似物。Magainins對革蘭陽性菌、陰性菌、真菌、原生動物都有殺傷作用，但是對革蘭陰性菌的活性比cecropins要低10倍左右[6]。

（2）富含某種氨基酸（但不含Cys）的抗菌肽。在其結(jié)構(gòu)中有一種或兩種氨基酸殘基重復(fù)出現(xiàn)，如PR-39、Indolicidin和Histantins。

PR-39最先在1991年由Agerberth等人在豬的小腸中分離純化得到，對其序列分析顯示，PR-39由39個氨基酸殘基組成，故將其命名為PR-39（Proline-arginine-rich），其一級結(jié)構(gòu)中富含精氨酸（Arg）和脯氨酸（Pro）兩種氨基酸殘基，其中Arg10個、Pro19個，在其結(jié)構(gòu)中，精氨酸和脯氨酸形成的Pro-Arg-Pro結(jié)構(gòu)可能與細菌的磷脂膜的相互作用有關(guān)[7]。

（3）含1個二硫鍵的抗菌肽。該二硫鍵的位置通常在肽鏈C端。目前此類成員最少，最先被發(fā)現(xiàn)的是在牛嗜中性粒細胞中分離得到的Bactenecin，其由12個氨基酸組成，其中精氨酸有4個，并在其第2位和第11位氨基酸殘基間形成二硫鍵，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌都有抑制活性。這類抗菌肽還包括蛙Brevinins-1、-2等，都研究的較清楚。

（4）含2個或2個以上二疏鍵的抗菌肽，多為β-片層結(jié)構(gòu)。如防御素（Defensins）如爪蟾皮膚細胞中產(chǎn)生的Brevinins。有兩個或兩個以上二硫鍵，具有β-折疊結(jié)構(gòu)的抗菌肽。如綠蠅防御素(Phom lindefensin)，其分子內(nèi)有6個Cys形成3個分子內(nèi)二硫鍵，肽鏈C末段是帶有擬β-轉(zhuǎn)角的反向平行的β片層。

（5）來源于具有其他功能的大分子蛋白的抗菌肽，如羊毛硫抗生素（Lactoferricins）是一類由細菌基因編碼，在核糖體中合成，經(jīng)翻譯加工后而含有一些特殊有機基團的多肽抗生素。如乳鏈菌肽（Nisin），產(chǎn)自乳酸桿菌，含有羊毛硫氨酸、甲基羊毛硫氨酸等特殊基因，由34個氨基酸殘基組成，只對革蘭陽性菌有作用。

2 抗菌肽作用機理研究進展

雖然目前對抗菌肽的生物活性作用機制還沒有統(tǒng)一的理論體系，但大多數(shù)人認為抗菌肽主要通過作用于細胞膜而發(fā)揮其生物活性作用[8]。關(guān)于抗菌肽與細胞膜作用機制，比較認同的有“桶板”模型和“毯式”模型兩種方式。

2.1“桶板”模型“桶板”模型的理論早在1977年由Ehrenstein和Leca等人提出[9]。后在1988年Oren Z等人據(jù)此理論對抗菌肽對細胞膜的作用方式進行解釋。由于大多數(shù)的抗菌肽帶有正電荷，細胞膜帶負電荷，靜電吸引作用使抗菌肽在細胞膜表面發(fā)生聚合，單分子的抗菌肽形成多聚體，并以垂直細胞膜表面的形式將其疏水基團嵌入細胞膜的磷脂雙分子層內(nèi)，形成橫跨細胞膜的離子通道，其他的多聚體在通道周圍連續(xù)的插入，不斷擴大通道的范圍，在細胞膜表面形成大的孔洞結(jié)構(gòu)，細胞膜的完整性遭到破壞，細胞膜內(nèi)外可自由發(fā)生物質(zhì)交換，最終使膜發(fā)生崩解。雖然該理論確認了抗菌肽的陽離子性和兩親性結(jié)構(gòu)在作用機制中的重要作用。現(xiàn)在研究表明，抗菌肽的二級結(jié)構(gòu)為圓柱形的α-螺旋分子結(jié)構(gòu)，在圓柱形縱軸的一端為帶正電荷親水基，對稱端為疏水基[10]。但是在“桶板”理論中抗菌肽在嵌入細胞膜中是以垂直細胞膜的形式將疏水基插入磷脂層內(nèi)部，而不是帶正電荷的親水一段最先嵌入磷脂層，明顯和抗菌肽與細胞膜結(jié)合的靜電吸引動力學(xué)不相符，因此僅是疏水基在形成垂直孔道前，其在膜表面的“錨定”機制還有待深入研究。

2.2“毯式”模型 1992年P(guān)ouny Y提出“毯式”模型理論[11]。與“桶板”模型相比，在該學(xué)說中，抗菌肽同樣通過電荷吸引作用結(jié)合于細胞膜表面。但是，并不進入細胞膜內(nèi)部，大量抗菌肽被吸引結(jié)合至細胞膜表面后，像地毯一樣平行排列于細胞膜表面，當(dāng)抗菌肽的濃度達到一個臨界濃度時，在分子張力和疏水作用下，細胞膜的表面張力發(fā)生改變，抗菌肽所覆蓋范圍的細胞膜穩(wěn)定性下降，形成不穩(wěn)定的磷脂膜，細胞膜表面出現(xiàn)明顯的皺褶彎曲甚至破裂，可使細胞膜內(nèi)外發(fā)生物質(zhì)相互滲透，改變細胞膜內(nèi)外的正常滲透壓，抗菌肽分子也可進入細胞內(nèi)部。目前已有學(xué)者通過對抗菌肽進行固態(tài)核磁共振實驗，研究結(jié)果支持該學(xué)說。王興順等采用偏光衰減全反射傅立葉變換紅外光譜技術(shù)（ATR-FTIR技術(shù)）對在蛾血淋巴中提取的Cecropin P1進行研究發(fā)現(xiàn)，Cecropin P1與細胞膜結(jié)合后緊貼在細胞膜表面而不進入疏水環(huán)境，Cecropin P1覆蓋區(qū)域的細胞膜穩(wěn)定性下降，并破壞膜的完整性[13]。

2.3 抗菌肽作用機制研究進展 He、Lazaridis T等人采用基于粗?；Ｐ偷哪M方法建立了53種具有α-螺旋結(jié)構(gòu)的天然抗菌肽的隱式膜模型[13]。通過對收集到關(guān)于抗菌肽分子在磷脂雙分子層聚集的模擬過程中結(jié)合能與自由能等熱動力學(xué)數(shù)據(jù)，以及表面電荷變化的數(shù)據(jù)，分析發(fā)現(xiàn)，決定抗菌肽的生物活性的兩個重要因素：抗菌肽與膜的親和力以及所結(jié)合生物膜所能承受的臨界表面覆蓋率（可能在50%～90%）。相比于計算機全原子模擬，隱式膜的模擬方法可在更長時間尺度和更大空間尺度上提供模擬體系的自由能、溫度、壓力等關(guān)于蛋白質(zhì)分子在脂質(zhì)雙分子層上聚集過程的分子動力學(xué)和熱力學(xué)數(shù)據(jù)[14]。真核細胞膜和細菌膜表面所帶電荷含量的不同影響了抗菌肽對他們選擇的特異性，因為模擬抗菌肽的抑菌過程中，能量轉(zhuǎn)移多發(fā)生在陰離子脂質(zhì)含量超過30%的膜與抗菌肽之間。而在模擬溶血過程中，能量轉(zhuǎn)移多發(fā)生在陰離子脂質(zhì)含量在10%左右的生物膜與抗菌肽之間。而且抗菌肽自身的表面結(jié)合率是指示其抑菌活性的一個重要指標(biāo)，疏水基嵌入生物膜的深度是影響溶血活性的重要因素，而其抗菌活性和溶血活性都受其自身結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響。

Lopez-Oyama等通過對二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）脂雙層及十四酰磷脂酸（DMPG）與陽離子抗菌肽Bactenecin間的相互作用探索“毯式”模型的形成機制，在電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)肽吸附在DPPC上的過程，顯示DMPG聚集組裝肽，形成類似于地毯形狀的長絲狀網(wǎng)格[15]。

Anne等在對枯草芽孢桿菌中一種陽離子多肽（Tat A）進行研究時發(fā)現(xiàn)，由于自身帶正電荷的特性，Tat A通過電荷的吸引作用和相鄰的蛋白質(zhì)在連接點進行折疊，形成類似于拉鏈“咬合牙齒”的結(jié)構(gòu)，在抗菌肽作用于細菌生物膜的過程中，這種電荷”拉鏈原則”，可以將電荷拉鏈浸入疏水的磷脂雙分子膜從而產(chǎn)生一種壓力效應(yīng)，抑制細菌生物膜的產(chǎn)生[16]。

Mei Hong等通過核磁共振分析豬源抗菌肽Protegrin-1（PG-1）的在細胞脂質(zhì)雙層中的研究發(fā)現(xiàn)，PG-1通過自耦連作用以多聚體的形式插入脂質(zhì)層內(nèi)部，形成跨膜通道，且革蘭陰性菌細胞膜上脂多糖（LPS）的強負電荷特性，在抗菌肽對細胞生物膜的選擇過程中起重要作用[17-18]。

3 抗菌肽分子設(shè)計的研究策略

在目前，對抗菌肽的抗菌機理，細胞毒性、溶血活性等機制雖尚無統(tǒng)一理論，但是大多數(shù)理論都認為其生物活性與其自身的陽離子性和兩親性有密切的關(guān)系?？咕牡年栯x子性決定了其選擇性，能讓其與帶負電荷的微生物細胞膜發(fā)生靜電吸引而相互作用，疏水性的氨基酸殘基則保證了抗菌肽能有效的滲透或嵌入細菌細胞膜的脂質(zhì)雙分子層內(nèi)部，形成疏水通道，破壞膜的完整性，進而導(dǎo)致細胞膜裂解。因此，目前對抗菌肽進行分子改造，進行分子設(shè)計策略可概括為以下兩方面：

（1）以天然抗菌肽構(gòu)效關(guān)系為依據(jù)，通過C末端酰胺化、對其一個或者多個位置上的氨基酸殘基定點突變、改變肽鏈長度以及將結(jié)合不同的肽鏈優(yōu)點形成雜合肽等方式，設(shè)計一系列的抗菌肽類似物，篩選出具有更高活性、安全的抗菌肽。

（2）對比已測定具有α-螺旋結(jié)構(gòu)的天然抗菌肽氨基酸序列，通過序列修飾改變其α-螺旋結(jié)構(gòu)域及其帶的正電荷量、肽鏈長度，增強肽鏈的兩親性質(zhì)，設(shè)計新的序列模型，進而篩選出抗菌譜更廣、抑菌活性更高的抗菌肽。

Concetta Avitabile等人從歐洲林蛙中分離得到Temporin-B（TB），分析發(fā)現(xiàn)TB由13個氨基酸組成，一級結(jié)構(gòu)為LLPIVGNLLKSLL，實驗發(fā)現(xiàn)TB對革蘭陽性菌具有一定的抑制效果，由于脂多糖分子（LPS）間的自締合作用，TB不易穿透細菌膜壁，而對陰性菌抑制效果較差。通過對TB進行丙氨酸掃描定點突變處理，用丙氨酸代替其一級結(jié)構(gòu)序列中的一到兩個氨基酸殘基，得到16種TB類似物，通過抑菌試驗、細胞毒性及溶血性試驗。發(fā)現(xiàn)TB-G6A（即用疏水性更強的丙氨酸-A替換TB一級結(jié)構(gòu)中第6位的甘氨酸-G得到的類似物）抑制革蘭陽性菌的能力明顯增強，而TBP3A、TB-N7A、TB-S11A表現(xiàn)出與TBMIC接近的抑菌水平，其他的TB類似物則都完全失去了抑菌能力。在TB-G6A N端起始部位連續(xù)添加兩個賴氨酸（K)，延長了肽鏈長度，并增加了肽鏈的正電荷量至+4，得到一級結(jié)構(gòu)為KKLLPIVANLLKSLL的類似物TB-KKG6A，與TB-G6A相比TB-KKG6A對革蘭陽性菌及陰性菌的抑菌活性有明顯的提升，對革蘭陰性菌的抑制效果也有一定程度的增強，且不表現(xiàn)溶血活性[19]。

Yanga等通過對富含精氨酸和脯氨酸的抗菌肽Tritrpticin進行研究，用賴氨酸替換Tritrpticin氨基酸序列中的精氨酸，雖然二者的空間結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生明顯的改變，但改變后的抗菌肽抑菌活性增加了2倍且溶血性大大降低。天然的Tritrpticin具有極強的結(jié)合兩性離子和陰離子的能力，而替換后的Tritrpticin僅與陰離子有極強的結(jié)合能力，而與兩性離子的結(jié)合能力降低[20]。

蝎子的抗菌肽IsCT，該抗菌肽沒有細胞選擇性，對哺乳動物和細菌細胞都有溶解活性。為了探索IsCT的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，Lee等設(shè)計一種新型具有細菌特異選擇性的抗菌肽，并合成了幾個IsCT的類似物，2D-NMR核磁共振分光術(shù)分析溶液中類似物的三維結(jié)構(gòu)。類似物[K7]-IsCT，從第2位的Leu到第13位的Phe是一個線性α-螺旋；類似物[K7，P8，K11]-IsCT中間有一個彎折，且其標(biāo)下暗處最強的抗菌活性而無溶血活性，說明脯氨酸引起的彎折對IsCT的選擇性有重要作用。色氨酸熒光顯示[K7，P8，K11]-IsCT的細菌高選擇性和其對富含陰離子磷脂類的高度選擇性有密切關(guān)系[21]。

4 前景展望

2011年，印度新德里NDM-1超級細菌的發(fā)現(xiàn)，引起了人們對抗生素使用的擔(dān)憂，調(diào)查發(fā)現(xiàn)細菌的耐藥性問題。而抗菌肽由于抗菌機制獨特，不易引發(fā)細菌耐藥性問題，成為發(fā)展新型抗菌劑的研究熱點。但是，目前對于對抗菌肽的生物活性機制的認識還處于模糊和分散的狀態(tài)。因此對抗菌肽的研究重點在于通過對其抑菌作用進行綜合、廣泛的研究，通過明確的生物活性機制理論，推動抗菌肽產(chǎn)品的開發(fā)與臨床應(yīng)用。

自第一個抗菌肽Cecropin發(fā)現(xiàn)30多年以來，由于其生物活性機制獨特，又在自然界廣泛分布，一直是人們研究的熱點。在“肽時代”真正到來之前，我們需要解決的問題還有以下幾個方面：（1）來源問題：天然抗菌肽資源有限，分離提取工藝復(fù)雜，通過化學(xué)方法合成的成本高昂；（2）抗原性問題：與化學(xué)藥物分子相比，抗菌肽的分子量要大得多，故其抗原性也可能比較強，抗菌肽是否會成為一種強致敏原還尚未可知；（3）因為抗菌肽屬于一種活性蛋白質(zhì)，做為口服用藥，如何避免消化道酶的消化作用還有待研究。

目前，對已發(fā)現(xiàn)抗菌肽的結(jié)構(gòu)特征及生物學(xué)活性研究已經(jīng)比較徹底，但其作用的機制及其與結(jié)構(gòu)之間存在的具體關(guān)系，目前還不是很清楚。本文通過對影響抗菌肽活性的重要因素，如氨基酸一級結(jié)構(gòu)、肽鏈的長度、α-螺旋結(jié)構(gòu)、特殊氨基酸、正電荷量、疏水性、親水性等方面進行了闡述，并對目前人們較為認可的兩種抗菌肽作用機制：“毯式”模型及“桶板”模型的最新研究進展總結(jié)，力求為人工合成抗菌肽的分子設(shè)計奠定理論基礎(chǔ)。

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