黃建琴，聶少平，張莘莘，黃丹菲，李文娟，謝明勇

（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌 330047）

靈芝（Ganoderma lucidum）是我國最具有研究價值的著名藥用真菌之一，同時也是一種新資源食品［1］。靈芝多糖被認(rèn)為是靈芝中最有效的生物活性成分之一，研究證實具有很強的生物活性［2］。大量研究表明，靈芝的滋補強身、扶正固本之功效與靈芝多糖的免疫增強活性密切相關(guān)［3］。

目前，國內(nèi)外大量研究表明，靈芝多糖具有明顯的免疫調(diào)節(jié)活性，特別是在靈芝多糖發(fā)揮抗腫瘤的研究中，同時伴隨著宿主免疫功能的增強，但其具體作用機制尚未完全清楚［4］。在本項目組前期研究基礎(chǔ)上，本實驗擬通過建立S-180荷瘤小鼠模型，繼而收集荷瘤小鼠中免疫細(xì)胞，通過給予不同劑量的黑靈芝多糖（PSG-1），研究PSG-1對荷瘤小鼠免疫細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，初步探討黑靈芝多糖的抗腫瘤機制。

1 材料與方法

1.1 材料 黑靈芝多糖由本實驗室制備，純度大于99.8%。BALB／c清潔級小鼠，♀，體質(zhì)量（22±2）g，購自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物房。S-180細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組及造模 取30只小鼠用于建立荷瘤小鼠模型，8只小鼠作為正常對照組。用PBS將S-180細(xì)胞懸液濃度調(diào)節(jié)至每毫升1×106個，每只0.2 m l接種于小鼠右肢腹股溝處。靜養(yǎng)約1周后，小鼠右肢處出現(xiàn)腫瘤塊，造模成功。

1.2.2 腹腔巨噬細(xì)胞及脾細(xì)胞的分離純化 正常小鼠及S-180荷瘤小鼠頸椎脫臼處死，放入碘伏3 min，75%酒精中浸泡3 min脫碘，腹腔注入5 ml預(yù)冷的PBS緩沖液，用棉球輕柔腹部1～2 min后，吸取腹腔液于離心管中，重復(fù)洗3次，收集以上PBS。無菌分離小鼠脾臟，在200目的細(xì)胞篩上碾磨，PBS沖洗3次，收集以上PBS。再分別以1 000 r·min－1離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞。

參照前期研究［5］，在細(xì)胞中加入PSG-1使其終濃度為20、40、80、160 mg·L－1，另設(shè)模型、正常及陽性對照組（LPS，終濃度10 mg·L－1），每組設(shè)5個復(fù)孔。置二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

1.2.3 中性紅吞噬試驗 腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，以PBS洗滌，加入1 g·L－1的中性紅生理鹽水溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。傾去上清液，用PBS洗3遍，每孔加入細(xì)胞裂解液（乙醇∶冰醋酸 ＝1∶1）100μl，室溫下放置2～3 h，待細(xì)胞溶解后，在酶標(biāo)儀上測定540 nm處吸光度。

1.2.4 巨噬細(xì)胞NO生成的測定 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，離心，取上清液，采用硝酸還原酶法測定上清液中NO含量，具體操作方法按照相應(yīng)的試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.5 細(xì)胞上清液中 TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ含量的測定

細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，離心，取上清液，采用夾心ELISA法測定 TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ含量，具體操作方法按照相應(yīng)的試劑盒說明進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 測定結(jié)果數(shù)據(jù)均用表示，采用SPSS 11.70統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2．1 PSG-1對巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力明顯低于正常小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力，以不同濃度PSG-1作用24 h后，與未經(jīng)任何處理的荷瘤小鼠組相比，荷瘤小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力有明顯的提高，高劑量組（＞40 mg·L－1）與正?？瞻捉M相比無明顯差異，高劑量組間差異無顯著性。

2．2 PSG-1對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響 荷瘤小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO量明顯低于正常小鼠巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的NO含量，但用PSG-1刺激后發(fā)現(xiàn)，荷瘤小鼠產(chǎn)生NO的量明顯增加，160 mg·L－1劑量組與正常空白組相比無差異，高劑量組間無差異。

2．3 PSG-1對巨噬細(xì)胞分泌 TNF-α、IL-1β的影響 實驗發(fā)現(xiàn)，荷瘤小鼠巨噬細(xì)胞的IL-1β分泌量高于正常小鼠的IL-1β分泌量，給予PSG-1后細(xì)胞因子分泌量增加更加明顯，呈劑量依賴關(guān)系；而荷瘤小鼠巨噬細(xì)胞分泌TNF-α量低于正常小鼠分泌TNF-α量，但PSG-1處理后，荷瘤小鼠來源的巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子的分泌量明顯增加并高于正常水平。

2．4 PSG-1對脾淋巴細(xì)胞分泌IL-6、IFN-γ的影響 實驗發(fā)現(xiàn)，荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-6量與正常小鼠無明顯差異，PSG-1刺激后分泌量明顯增加；而荷瘤小鼠高于正常小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ量，同時PSG-1刺激會使其明顯增加。

3 討論

靈芝能防止腫瘤的發(fā)生和抑制腫瘤生長，許杜娟等［6］建立肉瘤S-180、肝癌HepA及Lewis腹水癌小鼠模型，觀察不同濃度靈芝抗腫瘤作用，結(jié)果表明，靈芝能有效增加小鼠抑瘤率和生存率。黑靈芝作為靈芝種屬的重要成員之一，由于其免疫調(diào)節(jié)作用和抗腫瘤作用已經(jīng)引起越來越多關(guān)注，但是其活性成分探討及作用機制卻是直到最近才開始研究的。

在相關(guān)研究表明PSG-1具有體內(nèi)抗腫瘤作用的基礎(chǔ)上［7］，本實驗通過接種S-180于小鼠右腹股溝處建立荷瘤小鼠模型，無菌分離荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞及脾淋巴細(xì)胞用于體外實驗。結(jié)果顯示，PSG-1在體外可以明顯提高荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌NO、IL-1β和TNF-α的能力，同時提高脾淋巴細(xì)胞分泌IL-6、IFN-γ，從而達(dá)到提高荷瘤小鼠免疫功能的作用。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，PSG-1通過體外作用于荷瘤小鼠免疫細(xì)胞，增強其免疫功能，實現(xiàn)抗腫瘤的作用。本實驗也用于初步構(gòu)建多糖抗腫瘤免疫機制研究體系，進(jìn)一步為其他天然產(chǎn)物活性多糖的抗腫瘤活性機制研究提供理論依據(jù)，從而更有效地尋找具有低副作用且高效的抗腫瘤藥物。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 陳志杰，顧振新.靈芝主要活性物質(zhì)及液體深層發(fā)酵技術(shù)研究進(jìn)展［J］.食品研究與開發(fā)，2008，29（3）：186－90.

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［3］ Liu F J，Zhao X N.Rehmannia glutinosa oligosaccharides enhance the immune function inmice［J］.Chin Pharmacol Bull，1998，14（1）：90

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［5］ 張莘莘，李文娟，聶少平，等.黑靈芝多糖對體外培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能的影響［J］.中國藥理學(xué)通報，2010，26（9）：1139－42.

［5］ Zhang SS，LiW J，Nie SP，et al.The effect of polysaccharides from Ganoderma atrum on function of peritoneal macrophagein vitro［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26（9）：1139－42.

［6］ 許杜娟，陳敏珠.靈芝膠囊抗腫瘤作用研究［J］.安徽醫(yī)藥，2003，7（4）：243－5.

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［7］ Zhang SS，Nie SP，Huang D F，et al.Immunomodulatory effect of Ganoderma atrum polysaccharide on CT26 tumor bearing mice［J］.Food Chem，2013，136（3-4）：1213－9.