章檢明，任璐雅，易華西*，張?zhí)m威

（哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院中法乳聯(lián)合實驗室，黑龍江哈爾濱150090）

乳酸菌細菌素的高效表達方法研究

章檢明，任璐雅，易華西*，張?zhí)m威

（哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院中法乳聯(lián)合實驗室，黑龍江哈爾濱150090）

乳酸菌細菌素作為天然的生物防腐劑，因其高效、無毒等特點而備受關(guān)注，但目前只有乳酸鏈球菌素實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。乳酸菌細菌素產(chǎn)量低是限制其大規(guī)模生產(chǎn)的瓶頸之一。從高產(chǎn)菌株篩選、發(fā)酵條件調(diào)控、基因工程技術(shù)、誘導(dǎo)調(diào)控和脅迫刺激應(yīng)答5個方面，綜述了提高乳酸菌細菌素產(chǎn)量的方法，期望為提高乳酸菌細菌素產(chǎn)量的研究提供新思路。

乳酸菌；乳酸菌細菌素；方法；產(chǎn)量

乳酸菌細菌素是由乳酸菌在代謝過程中由核糖體產(chǎn)生的一類小分子質(zhì)量、安全無毒，并且具有抗菌活性的蛋白質(zhì)或多肽。目前，以nisin為代表的乳酸菌細菌素作為天然的食品防腐劑已廣泛的應(yīng)用于乳制品、肉制品等食品工業(yè)中，以延長產(chǎn)品的貨架期[1-2]。根據(jù)乳酸菌細菌素的分子質(zhì)量大小、抗菌譜、穩(wěn)定性等性質(zhì)的不同，可將其分為4類。第1類（classⅠ）為含羊毛硫氨基酸的細菌素，它是一種具有熱穩(wěn)定性，有較廣的抑制譜、包含羊毛硫氨基酸、不飽和氨基酸等，分子質(zhì)量＜5 ku的多肽，nisin就屬于這一類。第2類（classⅡ）為不含羊毛硫氨基酸的細菌素，其是一種具有熱穩(wěn)定性的，分子質(zhì)量＜10 ku的活性多肽，以片球菌素（pediocin）為代表。第3類（classⅢ）為熱敏感性的，分子質(zhì)量＞30 ku的大分子蛋白。第4類（classⅣ）為復(fù)合型細菌素，其抗菌活性通常需要與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或碳水化合物共同作用[3-4]。對于乳酸菌細菌素的一些特性，包括酸堿耐受性、熱敏感性、抑菌譜、蛋白酶敏感性等，不同類型的細菌素差別較大。目前對乳酸菌細菌素的研究主要集中在classⅠ和classⅡ上，但只有乳酸鏈球菌素（nisin）和少數(shù)片球菌素（pediocin）真正用于商業(yè)化生產(chǎn)，其他的細菌素都還不能進行大規(guī)模的生產(chǎn)，其中一個主要原因就是乳酸菌細菌素產(chǎn)量低，不足以滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求。為此，本文綜述了目前關(guān)于提高乳酸菌細菌素產(chǎn)量的方法，期望為加快乳酸菌細菌素工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 篩選乳酸菌細菌素高產(chǎn)菌株

當前國內(nèi)外研究人員都致力于高產(chǎn)細菌素乳酸菌的篩選。LUO F等[5]從傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛乳中篩選得到了5株產(chǎn)細菌素的乳酸菌，對金黃色葡萄糖球菌（Staphylococcus aureus）和產(chǎn)氣腸桿菌（Escherichia aerogenes）有較強抑制性；DE MARTINIS E C P等[6]從巴西肉制品中篩選得到了2株具有抗李斯特菌的明串珠菌（Leuconostocsp.）20和沙克乳酸桿菌（Lactobacillus sakei）29；PONCE A G等[7]從發(fā)酵蔬菜篩選得到了4株抗李斯特菌（Listeria monocytogenes）和沙門氏菌（Salmonella typhimurium）的尿腸球菌（Enterococcus faecium）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、海氏腸球菌（Enterococcus hirae）和狗鏈腸球菌（Enterococcus canis）[7]；呂好新等[8]從發(fā)酵乳制品中篩選得到了一株產(chǎn)廣譜細菌素的明串珠菌（Leuconostoc）；張小美等[9]從嬰兒糞便中分離獲得了一株對革蘭氏陰性菌和陽性菌均有抑制作用的干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）。雖然國內(nèi)外研究人員在篩選產(chǎn)細菌素乳酸菌方面做了大量研究，但除了nisin外，實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的乳酸菌細菌素鮮有報道。究其原因主要是還未發(fā)掘到能彌補nisin缺點、具有工業(yè)化前景的乳酸菌細菌素。目前classⅡa細菌素被認為是最有產(chǎn)業(yè)化前景的乳酸菌細菌素，但其篩選方法一般是應(yīng)用瓊脂擴散法，存在著篩選周期長、工作量大、重復(fù)性差等缺點。如何快速、有效的從蘊含大量乳酸菌的發(fā)酵食品中發(fā)掘獲得高效、廣譜的classⅡa乳酸菌細菌素是目前在該領(lǐng)域的研究熱點。易華西等[10]根據(jù)classⅡa乳酸菌細菌素N端的保守氨基酸序列，建立了基于聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）技術(shù)的快速篩選方法；MACWANA S J等[11]根據(jù)目前已經(jīng)報道的細菌素的氨基酸結(jié)構(gòu)及基因序列等生物信息，開發(fā)出了類似于基因芯片的快速篩選方法。上述方法雖然具有快速的特點，但由于classⅡa細菌素的多樣性，篩選靶點還存在特異性不強等缺點，目前有待開發(fā)一種快速、高效的高通量篩選方法。

2 發(fā)酵條件及培養(yǎng)基優(yōu)化

發(fā)酵條件（發(fā)酵時間、pH、發(fā)酵溫度、接種量等）影響著乳酸菌合成細菌素的能力。研究發(fā)現(xiàn)，初始pH和發(fā)酵溫度對乳酸菌細菌素產(chǎn)量影響最大[12]。胡敏等[13]利用響應(yīng)面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）HJD.A32產(chǎn)細菌素的發(fā)酵條件，發(fā)現(xiàn)當pH 5.3，發(fā)酵溫度為30℃時細菌素的效價最高；馬靜等[14]研究發(fā)現(xiàn)尿腸球菌HY07產(chǎn)細菌素的優(yōu)化發(fā)酵條件為pH 6，溫度37℃。由此可見，乳酸菌產(chǎn)細菌素的最適pH和溫度具有菌株特異性。通常來說，細菌素在指數(shù)增長前期開始合成，在指數(shù)增長末期或穩(wěn)定前期達到最大值[15-16]。MATARAGAS M等[17]研究腸膜明串株菌（Leuconostoc mesenteroides）L124和彎曲乳桿菌（Lactobacilluscurvatus）L442合成細菌素時發(fā)現(xiàn)，這兩株菌均在指數(shù)增長前期開始合成細菌素，直到指數(shù)增長末期達到最大值。尚楠等[18-19]也得到了相似的結(jié)論。接種量對乳酸菌產(chǎn)細菌素的影響目前存在著分歧，造成這一原因可能是細菌素的合成受到群體感應(yīng)的調(diào)節(jié)。劉國榮等[20]的研究發(fā)現(xiàn)接種量對細菌素的合成影響不顯著，但陳琳等[21]研究發(fā)現(xiàn)接種量對植物乳桿菌產(chǎn)細菌素的影響顯著，僅次于初始pH的影響。通過優(yōu)化發(fā)酵條件，雖然從一定程度上能提高乳酸菌細菌素的產(chǎn)量，但增產(chǎn)的幅度有限，并且產(chǎn)細菌素最適發(fā)酵條件一般與菌體最適生長條件不一致，不能解釋其增產(chǎn)作用機制和調(diào)控機理，不能從根本上去解決提高乳酸菌細菌素產(chǎn)量的問題。

培養(yǎng)基成分（如碳源、氮源、無機鹽等）對乳酸菌產(chǎn)細菌素也具有影響。ANASTASIADOU S等[22]研究了不同碳源（葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、甘油）對乳酸片球菌（Pedio coccusacidilactici）NRRLB5627產(chǎn)細菌素的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葡萄糖是最有利于產(chǎn)細菌素的碳源，而甘油對細菌素的合成有強烈的抑制作用。KIM M H等[23]發(fā)現(xiàn)酵母提取物、胰蛋白胨和高濃度的磷酸鹽有利于微球菌（Micrococcussp.）GO5合成細菌素GO5。LI C等[24]研究了培養(yǎng)基成分對乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）ATCC 11454產(chǎn)細菌素的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)硫酸鎂濃度對于細菌素的產(chǎn)量沒有顯著影響。TODOROV S D等[25]認為最適于腸球菌產(chǎn)抗菌肽ST4SA的硫酸鎂質(zhì)量濃度為0.1 g/L。由于不同乳酸菌產(chǎn)細菌素所需的最適培養(yǎng)基成分濃度不同，所以通過優(yōu)化培養(yǎng)基成分來提高乳酸菌細菌素產(chǎn)量的方法顯然具有很大的局限性和不確定性。目前所用的培養(yǎng)基主要是MRS和M17或基于上述兩種組分的改良培養(yǎng)基，從成本上考慮是不經(jīng)濟的。因此基于生產(chǎn)成本，國外研究者開展了經(jīng)濟型培養(yǎng)基的篩選和優(yōu)化，比如利用乳清、工業(yè)廢水、糖蜜等工業(yè)副產(chǎn)品[26]。

3 基因工程技術(shù)提高乳酸菌細菌素產(chǎn)量

利用基因工程技術(shù)來提高乳酸菌細菌素產(chǎn)量的研究主要集中在基因工程菌構(gòu)建。目前產(chǎn)乳酸菌細菌素異源表達系統(tǒng)主要有3類：大腸桿菌（Escherichia coli）表達系統(tǒng)、乳酸菌表達系統(tǒng)和酵母表達系統(tǒng)，其中以大腸桿菌表達系統(tǒng)研究最多。但是，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)分泌的細菌素大多都不能釋放到胞外，而是以融合蛋白形式存在于胞內(nèi)。KLOCKE M等[27]將編碼尿腸球菌產(chǎn)細菌素的基因?qū)氪竽c桿菌中使其表達，而其表達的細菌素存在于胞內(nèi)。這就造成在提取純化細菌素時需要對細胞進行裂解、酶解等過程，導(dǎo)致操作程序繁瑣，并且還增加了成本[28]。此外，大腸桿菌本身并不是一般認為安全（generallyrecognizedassafe，GRAS）菌株，其表達產(chǎn)物是否可直接應(yīng)用于食品工業(yè)還有待于進一步研究[29]。

乳酸菌表達系統(tǒng)克服了以大腸桿菌作為宿主存在的安全隱患，可以直接將構(gòu)建的乳酸菌加入到食品中，免去了細菌素分離提純等的步驟[30]。但是，目前對于乳酸菌作為宿主進行異源表達產(chǎn)細菌素的報道較少，主要的原因是其表達的細菌素活性不高。SANCHEZ J等[31]將腸球菌（Enterococcus）DCH5細菌素基因?qū)氲饺樗崛榍蚓?，并使其表達相應(yīng)的細菌素，結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)異源表達的細菌素活性不如原宿主菌產(chǎn)的細菌素活性強。另外，目前以乳酸菌為宿主的表達系統(tǒng)大多是以抗生素（氯霉素、紅霉素等）作為篩選標記，從食品安全角度考慮，抗生素標記的表達系統(tǒng)是不能用于食品生產(chǎn)的。因此，尋找安全、無毒的篩選標記顯得尤為重要。LIU G等[32]以nisin免疫基因（nisin Ι）為篩選標記，乳酸乳球菌為表達宿主，構(gòu)建了完全食品級表達系統(tǒng)，從而產(chǎn)生安全、無毒的細菌素。

目前對于酵母異源表達細菌素的研究報道較少，主要問題與乳酸菌表達系統(tǒng)類似，宿主表達的細菌素?zé)o活性或活性較低。如BEAULIEU L等[33]利用畢赤酵母（Pichiapastoris）異源表達產(chǎn)生片球菌素Pediocin PA-1，雖然能產(chǎn)生胞外重組片球菌素，但胞外重組片球菌素?zé)o抗菌活性?？傊?，利用基因工程技術(shù)來提高乳酸菌細菌素產(chǎn)量的方法在理論上是可行的，但普遍存在著表達的細菌素活性較低等問題，因此找到一種能夠表達高活性細菌素，并且構(gòu)建出完全食品級表達系統(tǒng)是當前研究的重點。

4 誘導(dǎo)調(diào)控提高乳酸菌細菌素產(chǎn)量

近幾年研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌存在著調(diào)節(jié)細菌素合成的群體感應(yīng)系統(tǒng)[34-35]，通過某種信號分子來誘導(dǎo)啟動特定基因的表達。當前，利用誘導(dǎo)調(diào)控來提高乳酸菌細菌素產(chǎn)量的方法主要包括兩種：自我誘導(dǎo)和外源誘導(dǎo)。自我誘導(dǎo)指的是菌體自身所分泌的某種物質(zhì)可以誘導(dǎo)該物質(zhì)的合成。例如，nisin不僅是一種具有抗菌活性的細菌素，還具有自我誘導(dǎo)合成功能。NILSEN T等[36]研究尿腸球菌（Enterococcus faecium）CTC492產(chǎn)細菌素的自我誘導(dǎo)功能時發(fā)現(xiàn)，尿腸球菌CTC492能分泌一種能誘導(dǎo)自身細菌素合成的誘導(dǎo)因子（induction factor，EntF），并且Entf誘導(dǎo)尿腸球菌CTC492細菌素的合成具有劑量依賴性。目前，國內(nèi)對于研究自誘導(dǎo)提高乳酸菌細菌素產(chǎn)量的報道比較少。易華西[37]研究發(fā)現(xiàn)，副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）-J23產(chǎn)細菌素Bac-J23存在自我誘導(dǎo)現(xiàn)象，同樣也體現(xiàn)出劑量依賴性。葛菁萍等[38]研究發(fā)現(xiàn)，添加細菌素Paracin1.7可使干酪乳桿菌（Lacto bacillus casei）HD1.7合成其產(chǎn)量提高10.72%。雖然，研究證明了乳酸菌產(chǎn)細菌素存在著自我誘導(dǎo)現(xiàn)象，但目前對于產(chǎn)細菌素相關(guān)的群體感應(yīng)系統(tǒng)的研究還不夠完善，自誘導(dǎo)物的調(diào)控機理及策略還不清楚。隨著乳酸菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的深入研究，利用自我誘導(dǎo)提高乳酸菌細菌素產(chǎn)量的方法將成為新的研究熱點。

外源誘導(dǎo)是指向培養(yǎng)液中加入非培養(yǎng)液成分的外源物質(zhì)誘導(dǎo)細菌素的合成。通常認為前體物質(zhì)或代謝中間產(chǎn)物具有誘導(dǎo)目標產(chǎn)物合成的作用。乳酸菌細菌素是蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)，因此氨基酸可以作為合成乳酸菌細菌素的外源誘導(dǎo)物。另外，丙酮酸和甘油作為微生物代謝途徑中合成的一種重要的中間代謝物，有可能參與細菌素的合成代謝。VáZQUEZ J A等[39]研究氨基酸對nisin合成的影響時發(fā)現(xiàn)，半胱氨酸和色氨酸對nisin的合成有促進作用，而脯氨酸卻不利于nisin的合成。易華西[37]以谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、丙氨酸、丙酮酸和甘油為對象，發(fā)現(xiàn)半胱氨酸、甘氨酸、丙酮酸和甘油對細菌素Bac-J23的合成有誘導(dǎo)作用。ANASTASIADOU S等[22]研究發(fā)現(xiàn)，若以甘油為唯一碳源，乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）NRRLB5627合成片球菌素的產(chǎn)量將明顯降低，可能是甘油作為碳源不能使乳酸片球菌NRRL B5627很好的生長，導(dǎo)致其合成細菌素能力下降。利用外源物誘導(dǎo)提高乳酸菌細菌素產(chǎn)量的研究，目前還處于起始階段，對其誘導(dǎo)機理和調(diào)控方法還有待于進一步的研究。

5 脅迫刺激乳酸菌合成細菌素

生態(tài)脅迫刺激一般可以分為2種形式：第1種是乳酸菌與其他微生物共培養(yǎng)（特別是敏感菌），為了獲得有利生長環(huán)境，會大量釋放細菌素來殺死或抑制其它微生物的生長；第2種是某些環(huán)境壓力可以刺激菌體釋放細菌素，從而更好的適應(yīng)不良生長環(huán)境。MALDONADO A等[40]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）NC8和尿腸球菌6T1a-20、戊糖片球菌FBB63等微生物共培養(yǎng)時，能顯著的增加植物乳桿菌NC8合成細菌素；TABASCO R等[41]發(fā)現(xiàn)當嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）La-5與嗜熱鏈球菌、德式乳酸桿菌等共培養(yǎng)時，能夠增加其細菌素的產(chǎn)量。ROJO-BEZARES B等[42]分別以乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）MG1363、希氏乳桿菌（Lactobacillus hilgardii）J81和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）FBB63為誘導(dǎo)菌，與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）J23共培養(yǎng)，研究發(fā)現(xiàn)活的誘導(dǎo)菌并不是誘導(dǎo)細菌素合成所必需的，誘導(dǎo)物質(zhì)沒有釋放到培養(yǎng)基中。然而，國內(nèi)研究植物乳桿菌KLDS1.0706、KLDS4.0315、KLDS4.0351和羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）KLDS1.0736與植物乳桿菌KLDS 1.0391共培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)活的誘導(dǎo)菌是植物乳桿菌KLDS 1.0391合成細菌素所必需的[43]，這與ROJO-BEZARESB等[42]的結(jié)果相矛盾。目前，利用微生物共培養(yǎng)方法提高乳酸菌細菌素產(chǎn)量的研究還不是很完善，共培養(yǎng)誘導(dǎo)物是蛋白質(zhì)或肽類，還是誘導(dǎo)菌體細胞結(jié)構(gòu)等對導(dǎo)機理還不清楚。

當乳酸菌在惡劣的環(huán)境下生長時，一些環(huán)境壓力能刺激其細菌素的合成。乳酸菌對于惡劣環(huán)境的應(yīng)答與乳酸菌本身的特性和施加環(huán)境壓力類型有關(guān)。LEROY F等[44]研究不同環(huán)境壓力（氧壓力、鹽壓力、糖壓力、營養(yǎng)素壓力）對尿腸球菌RZSC5產(chǎn)細菌素的影響，結(jié)果表明，氧壓力對細菌素的合成沒有顯著影響，而中等鹽濃度（20～40 g/L）能夠提高細菌素的活性，而當對糖和營養(yǎng)素進行限制時，其對細菌素產(chǎn)量沒有影響；PAPAGIANNI M等[45]發(fā)現(xiàn)在溶解氧張力（dissolved oxygen tension，DOT）為100%和50%時，亞硝酸鈉對類腸膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）產(chǎn)細菌素有抑制作用，而在厭氧條件下時，亞硝酸鈉對類腸膜魏斯氏菌產(chǎn)細菌素沒有影響。目前，有關(guān)通過施加環(huán)境壓力來提高乳酸菌細菌素產(chǎn)量的報道很少。主要是環(huán)境壓力對合成細菌素的影響因素很復(fù)雜，而且其影響機理還不十分清楚。但隨著在這樣面的深入研究，相信通過環(huán)境壓力來提高乳酸菌細菌素產(chǎn)量的方法將會有更大的突破。

6 總結(jié)與展望

目前，發(fā)酵條件優(yōu)化仍然是提高乳酸菌細菌素最常用的方法，但存在費時、操作繁瑣、工作量大、產(chǎn)量增加幅度較小、不確定因素多等缺點。利用基因工程技術(shù)來提高乳酸菌細菌素產(chǎn)量的方法一直被研究者所重視，但利用基因工程方法合成的細菌素存在著一個很大的問題，即安全性問題，更重要的是由于基因沉默、基因組的保守性問題等不一定能提高產(chǎn)量，利用誘導(dǎo)調(diào)控和脅迫應(yīng)答提高細菌素產(chǎn)量是基于乳酸菌的代謝和生態(tài)的觀點，不涉及安全性問題，而且這兩個方法都被認為是在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié)，也是最經(jīng)濟的調(diào)節(jié)方式。因此，利用誘導(dǎo)調(diào)控和脅迫應(yīng)答來提高乳酸菌細菌素產(chǎn)量的方法必將成為該領(lǐng)域的研究熱點，有望為乳酸菌細菌素的大規(guī)模生產(chǎn)提供新思路。

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Strategies to increase bacteriocin production by lactic acid bacteria

ZHANG Jianming,REN Luya,YI Huaxi*,ZHANG Lanwei

(Sino-France Dairy Joint Laboratory,School of Food Science and Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China)

Bacteriocin by lactic acid bacteria as natural biological preservatives had been widely used in food industry due to the high efficient and non-toxic character.However,only nisin implemented industrialized production.The low bacteriocin production by lactic acid bacteria is one of the bottlenecks for its industrial production.Therefore,present methods available for increasing bacteriocin production by lactic acid bacteria were reviewed,which including high bacteriocin yield strain screening,fermentation conditions regulation,genetic engineering technology,induction regulation and stress stimulus response.It will provide some novel thoughts for increasing bacteriocin production by lactic acid bacteria.

lactic acid bacteria;bacteriocin;methods;production

Q939.92

A

0254-5071（2014）07-0029-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.006

2014-06-14

國家自然基金項目（30900996）；中國博士后基金特別資助項目（2012T50346）

章檢明（1990-），男，碩士研究生，研究方向為乳品微生物。

*通訊作者：易華西（1976-），男，副教授，博士，研究方向為乳品微生物。