董雪敏，叢培云*（威海市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，山東威海264209）

威海近海?？缴愷B(yǎng)菌的分離和多樣性分析

董雪敏，叢培云*
（威海市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，山東威海264209）

對(duì)綠?？墓哺缴愷B(yǎng)菌群進(jìn)行研究。從?？谋砻婧蛣驖{液中分離到60株異養(yǎng)菌株，采用16S rRNA基因序列分析和部分生理生化試驗(yàn)，確定其中56株菌的種屬情況。另外，對(duì)該類(lèi)菌株所產(chǎn)胞外酶的情況以及與弧菌的拮抗情況進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：這些可培養(yǎng)菌株的群落結(jié)構(gòu)多樣性較為豐富，其中的16株菌為假交替單胞菌屬及其相關(guān)類(lèi)群；其他菌株主要分布在其他19個(gè)屬中。其中，17株菌可產(chǎn)胞外蛋白水解酶；20株菌可產(chǎn)胞外脂肪酶；菌株NQ8對(duì)一些弧菌具有較強(qiáng)的拮抗作用。

綠海葵；細(xì)菌多樣性；16S rRNA基因；系統(tǒng)發(fā)育；鑒定

共附生細(xì)菌可能在清除宿主代謝廢物[1]和為宿主提供生物活性物質(zhì)[2-3]等方面扮演著重要角色。細(xì)菌-宿主關(guān)系生物學(xué)使得許多研究者對(duì)于研究共附生海洋微生物作為天然生物制品的來(lái)源產(chǎn)生相當(dāng)大的興趣[4]。海綿共附生菌產(chǎn)生的很多抗菌物質(zhì)已經(jīng)被分離到了，這說(shuō)明共附生菌對(duì)宿主可能具有保護(hù)作用。一些情況下，細(xì)菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)也被證明是與其宿主有關(guān)的。

因?yàn)楹Ｑ蠊哺缴⑸锏闹匾獌r(jià)值，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)展了不少相關(guān)研究，但還處于初級(jí)階段。國(guó)內(nèi)關(guān)于?？哺缴?xì)菌的研究報(bào)告很少，YANG B L等[5-6]都在?？邪l(fā)現(xiàn)了具有抗菌活性的細(xì)菌。謝新強(qiáng)等[7]指出從?？①O貝等分離到的活性菌株數(shù)高于其他動(dòng)物。國(guó)外關(guān)于?？哺缴⑸锏难芯恐饕杏诠采孱?lèi)，共附生細(xì)菌未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用16S rRNA基因序列分析來(lái)調(diào)查威海近海海葵共附生可培養(yǎng)細(xì)菌的生物多樣性，并對(duì)這些菌株產(chǎn)生胞外酶和拮抗物質(zhì)的情況進(jìn)行初步分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品采集：實(shí)驗(yàn)所用?？鸄nthopleura midori（刺胞動(dòng)物門(mén)，珊瑚蟲(chóng)綱，?？?，綠?？┯?008年4月份從威海近海（中國(guó)山東，緯度37.533 1°N；經(jīng)度122.061 9°E）潮間帶采集。采集的?？４嬷裂b有海水的標(biāo)本袋中，密封，防止?？c空氣直接接觸并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，并于超凈工作臺(tái)中及時(shí)處理。

2216培養(yǎng)基（海生細(xì)菌的增菌培養(yǎng)）：青島海博生物技術(shù)有限公司；PCR試劑盒：日本東洋紡株式會(huì)社上海子公司；吐溫80、胰蛋白酶和大豆瓊脂培養(yǎng)基等試劑由實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3750型高壓滅菌鍋：日本SANYO公司；BPX-162型恒溫培養(yǎng)箱：上海博迅公司；高速冷凍離心機(jī)、LS-D202型金屬?。好绹?guó)Thermo公司；Tanon-3500凝膠成像儀：上海天能科技有限公司；超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；PTC-200型PCR儀：美國(guó)伯樂(lè)公司；DYY-6c型DNA電泳儀：北京六一儀器廠；HH-1型水浴鍋：常州國(guó)華電器有限公司；HQ-60漩渦混合器：北京同正生物技術(shù)發(fā)展公司；DELTA 320pH計(jì)：梅特勒-特立多儀器有限公司；IS-RDS3型恒溫振蕩器：美國(guó)精騏有限公司；DW-86L-626型超低溫冰箱：青島海爾集團(tuán)；SIGMA1-14型常溫離心機(jī)：德國(guó)森馬公司；JY92-II型超聲波粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；Gene Quant 100紫外分光光度計(jì)：美國(guó)GE公司。

1.3 方法

1.3.1 ?？哺缴愷B(yǎng)細(xì)菌的分離

對(duì)海葵進(jìn)行無(wú)菌處理，即稱(chēng)質(zhì)量后用無(wú)菌海水反復(fù)清洗。將?？砻嬷苯釉谂囵B(yǎng)基上涂布以獲得其表面的細(xì)菌，暫時(shí)以BM、HK和JS標(biāo)記。解剖海葵得到1 cm2體腔壁，用無(wú)菌海水沖洗?？w腔（洗去體腔內(nèi)的顆粒物質(zhì)），將其研磨成漿，用無(wú)菌海水按照10-1～10-6的比例進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)訬Q標(biāo)記。在2216E固體培養(yǎng)基上涂布均勻，28℃下培養(yǎng)至菌株長(zhǎng)出。

1.3.2 PCR測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析

將菌株轉(zhuǎn)接入分離培養(yǎng)基中于恒定光源的恒溫培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)過(guò)夜。取一環(huán)單菌落懸浮于50 μL無(wú)菌去離子水中，100℃水浴加熱5 min，離心，取上清液作為PCR模板DNA。擴(kuò)增正向引物27F對(duì)應(yīng)于E.coli16S rDNA序列的第8～27個(gè)堿基位置，反向引物1492R對(duì)應(yīng)于E.coli 16SrDNA的第1 492～1 510個(gè)堿基位置，其序列分別為5′-AGAGTTTGATC（C/A）TGGCTCAG-3′和5′-TACGG（C/T）TACCTTGTTACGACTT-3′。100 μL PCR反應(yīng)體系組成為：1×PCR緩沖液，1.5 mmol/L MgC12，4×dNTP混合物各200 μmol/L，引物各0.5 μmol/L，TaqDNA聚合酶1 μL（5 U/μL），2 μL DNA原液。PCR反應(yīng)條件為：96℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，50℃復(fù)性1 min，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃溫育7 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，直接交由上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行純化和序列測(cè)定。所有的16S rRNA基因序列長(zhǎng)度在1000bp左右，已提交到GenBank并獲得GenBank收錄號(hào)。運(yùn)用Blast程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中已存在的細(xì)菌16S rRNA基因序列進(jìn)行相似性比較分析；序列的比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析采用MEGA（4.0）軟件。

1.3.3 生理生化特性

（1）鹽度耐受性試驗(yàn)

細(xì)菌分別培養(yǎng)在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、1%、3%、5%、7%、9%和11%的胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）培養(yǎng)基上。在28℃培養(yǎng)5 d后，以形成菌落的情況指示該菌的耐鹽性。

（2）胞外蛋白酶的測(cè)定

胞外蛋白酶的試驗(yàn)可以顯示菌株是否生產(chǎn)這類(lèi)酶，并能初步顯示其產(chǎn)酶能力。將脫脂牛奶以終體積分?jǐn)?shù)5%加入滅菌的2216E培養(yǎng)基中。接種后，在28℃培養(yǎng)5 d，通過(guò)菌落周?chē)纬傻挠捎诘鞍踪|(zhì)顆粒被水解而清晰可見(jiàn)的透明環(huán)來(lái)判斷菌株是否產(chǎn)胞外蛋白酶，透明環(huán)的直徑反映其產(chǎn)酶能力。

（3）胞外脂肪酶的測(cè)定

吐溫是含有不同鏈長(zhǎng)的水溶性飽和脂肪酸溶液。10%的吐溫80單獨(dú)滅菌，然后以終體積分?jǐn)?shù)1%加入滅菌的2216E培養(yǎng)基中，添加0.01%（w/v）CaCl2·2H2O。接種后，在25℃培養(yǎng)7 d，通過(guò)菌落周?chē)纬傻拿黠@晶體（由于吐溫被水解而形成的不溶性鈣鹽）判斷菌株是否產(chǎn)脂酶。

（4）拮抗菌的篩選

利用瓊脂擴(kuò)散法和雙層瓊脂法[8]來(lái)測(cè)定菌株的抗菌活性。接種后，在28℃培養(yǎng)48 h，通過(guò)菌落周?chē)蛑甘揪鸁o(wú)法生長(zhǎng)而留下的透明圈來(lái)確定該菌株產(chǎn)生了抗菌物質(zhì)。測(cè)量菌落的直徑（Dc）和抑菌圈的直徑（Di），用Di/Dc的比值來(lái)確定抗菌能力的大小。供試菌有：E.coli，Staphylococcus aureus，Vibrio anguillarum，Vibrio aestuarianus，Vibrio alginolyticus，Vibrio campbellii，Vibrio carchariae，Vibrio cincinnatiensisi，Vibrio costiola，Vibrio damsela，Vibrio diazotrophicus，Vibrio fisheri，Vibrio fluvialis，Vibrio furnissi，Vibrio gazogenes，Vibrio harveyi，Vibrio vulnificus，Vibrio mediterranei，Vibriomimicus，Vibrionatriegens，Vibrionereis，Vibrio orientalis，Vibrio parahaemolyticus，Vibrio pelagia，Vibrioproteolyticus，Vibriosplendidus，Vibriotubiashii，Vibrio vulnificus，Vibrio logei，Vibrio hollisae，Vibrio parahaemolyticus。

2 結(jié)果與分析

2.1 ?？哺缴愷B(yǎng)細(xì)菌的分離

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，總共分離得到60株細(xì)菌。其中，31株是從?？捏w腔壁分離到的，29株是從體表分離到的。

2.2 16S rRNA基因序列分析

測(cè)定和分析了56株菌的16S rRNA基因序列信息，另外4株菌經(jīng)形態(tài)觀察和生理生化試驗(yàn)鑒定屬于Pseudoalteromonas屬，結(jié)果見(jiàn)表1。其中，28條基因序列來(lái)自分離自體腔壁的細(xì)菌，其余的來(lái)自?？w表細(xì)菌。所有序列被提交給GenBank，收錄號(hào)分別是FJ211070，F(xiàn)J205736，F(xiàn)J205738，F(xiàn)J205739，F(xiàn)J205740-FJ205752，EU939692-EU939694，EU 939696-EU939715和FJ810051-FJ810055。

一般認(rèn)為，16S rDNA序列同源性＞99%，可以認(rèn)為屬于同一個(gè)種；16SrDNA序列同源性＜98%，可以認(rèn)為屬于不同的種；同源性＜95%，可以認(rèn)為屬于不同的屬[9]。16S rRNA基因序列分析表明這些菌株具有很高的多樣性，分別屬于8個(gè)目（Alteromonadales，Vibrionates，Peseudomonadales，Oceanospirillales，Rhodobacterales，Bacillales，Actinomycetales，F(xiàn)lavobacteriales），11個(gè)科（Colwelliaceae，Alteromonadaceae，Vibrionaceae，Moraxellaceae，Pseudomonadaceae，Hahellaceae，Rhodobacteraceae，Bacillaceae，Staphylococcaceae，Micrococcineae，F(xiàn)lavobacteriaseae），21個(gè)屬（Colwellia，Vibrio，Acinetobacter，Pseudomonas，Endozoicomonas，Roseovarius，Paracoccus，Loktanella，Leisingera，Sulfitobacter，Bacillus，Staphylococcus，Plantibacter，Microbacterium，Micrococcus，Joostella，Psychroserpens，Cellulophaga，Krokinobacter，Polaribacter，Psychrobacter）。

表1 56株?？缴?xì)菌的16S rRNA部分序列的鑒定結(jié)果Table 1 Partial sequence 16S rRNA identification results of 56 strains anemones epiphytic bacteria

續(xù)表

續(xù)表

圖1 細(xì)菌部分的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of bacterium part

依據(jù)16S rRNA基因序列分析，得到了56株菌的系統(tǒng)發(fā)育分析樹(shù)（見(jiàn)圖1）。

根據(jù)16S rDNA序列分析的結(jié)果，32株菌可以鑒定到種的水平，另外24株能被鑒定到屬的水平。結(jié)果顯示28.6%的菌株（16株）屬于Pseudoalteromonas和近緣的屬，其中，13株菌來(lái)自?？w表。所以Pseudoalteromonas屬的菌是?？w表的優(yōu)勢(shì)菌種。第二大菌群是Rhodobacterales，11株菌（19.6%）經(jīng)鑒定屬于這個(gè)屬，其中9株菌是從體腔壁分離到的。這顯示Rhodobacterales屬菌是海葵體腔壁的優(yōu)勢(shì)菌。與已明確鑒定種的最大同源性＜97%的菌株可以被認(rèn)為是潛在的新種[10]，根據(jù)16S rRNA基因序列，發(fā)現(xiàn)7株菌，NQ2、NQ3、NQ10、NQ19、NQ21、BM6和HK3可能是潛在的新種。

2.3 鹽度耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)測(cè)試，有30株菌不能在無(wú)鹽的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，有16株可以在無(wú)鹽情況下生長(zhǎng)。另外有7株菌（HK10，NQ1，NQ2，NQ15，NQ29，NQ30，NQ31）在任何鹽度測(cè)試培養(yǎng)基上都不生長(zhǎng)，在除瓊脂外同樣配方的液態(tài)培養(yǎng)基中，也不生長(zhǎng)。分析其原因可能是海水中復(fù)雜的離子成分對(duì)于它們的生長(zhǎng)是必需的。大多數(shù)菌株在3%鹽度下生長(zhǎng)狀況最好，但是有15株菌例外。菌株BM2，BM5，HK1，HK3，HK7，HK12，NQ5最適鹽度分別在5%～7%；而菌株HK8，HK9，JS2，JS11，JS12，NQ2，NQ3，NQ20，NQ22的最適鹽度在0～2%。

2.4 胞外酶類(lèi)的測(cè)定

經(jīng)測(cè)定，17株菌產(chǎn)胞外蛋白酶，20株菌能夠產(chǎn)生胞外脂肪酶，結(jié)果見(jiàn)表2。其中，6株菌（NQ4，NQ5，NQ6，NQ8，NQ14，JS2）產(chǎn)酶能力較高，它們的Dt/Dc比值超過(guò)4。這6株菌中，其中5株來(lái)自?？w腔壁，這些菌株可能有助于幫助寄主消化食物中的蛋白。

表2 胞外酶測(cè)試結(jié)果Table 2 Determination result of extracellular enzyme

2.5 拮抗菌的篩選

經(jīng)篩選，菌株NQ8對(duì)許多供試菌有明顯的拮抗作用。試驗(yàn)結(jié)果表明NQ8對(duì)Vibrio aestuarianus（Dt/Dc=11.01），Vibrio anguillarum（10.95）和Vibrio harveyi（10.05）有較強(qiáng)的拮抗作用。另外，NQ8也拮抗E.coli（3.00），Staphylococcus aureus（4.30），Vibrio gazogelles（4.09）和Vibrio parahaemolyticus（7.88）。弧菌屬細(xì)菌能夠引起許多水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的病害，使水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)蒙受巨大損失，因此弧菌拮抗菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)有著巨大的應(yīng)用潛力。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，從威海近海?？缴⑸镏蝎@得具有較大價(jià)值的許多菌株。菌株HK12很可能是Polaribacter屬的新種，它與已明確鑒定的Polaribacter franzmannii有最高同源性（96.82%）。Polaribacter屬建于1998年，該屬的菌種都來(lái)自海洋，并且大部分是從極地海域分離出的[11-14]。Flavobacteriaceae科包括許多海洋菌株，被稱(chēng)為是系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上的“海洋的進(jìn)化枝”。菌株NQ5被鑒定為Vibriosp，與庫(kù)中已明確鑒定菌株的比對(duì)結(jié)果顯示NQ5與Vibrio splendidus（ATCC 33125T）同源性最高，達(dá)到96.86%。Vibrio屬是1854年建立的，該屬有30多個(gè)種，其中至少有12株是致病菌[15]。菌株HK3與Pseudoalteromonas arctica有96.52%的同源性。Pseudoalteromonas建立于1995年[16]，是Alteromonadales-Pseudoalteromonadaceae門(mén)重要的海洋菌屬。

許多生物學(xué)家認(rèn)識(shí)到共附生細(xì)菌是有價(jià)值的生物資源。他們研究過(guò)海綿、海參、魚(yú)類(lèi)、蝦類(lèi)等的共附生細(xì)菌[17-20]。本研究展示了海葵的價(jià)值，海葵共附生細(xì)菌有很高的多樣性，并且包括許多新的菌種。當(dāng)然，其他動(dòng)物甚至整個(gè)海洋都是物種資源的寶藏。

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Isolation and diversity analysis of symbiotic heterotrophic bacteria of green sea anemone in Weihai offshore

DONG Xuemin,CONG Peiyun*

(Weihai Product Quality Supervision and Testing Institute,Weihai 264209,China)

In this paper,the total symbiotic heterotrophic bacteria of the green sea anemone was studied.From the surface of the sea anemone and homogenate,60 heterotrophic bacterial strains were isolated by 16S rRNA gene sequence analysis and some physiological and biochemical test,to determine the genus of 56 strains.In addition,the production of extracellular enzyme andVibrioantagonism situation were determined as well.Results showed that the structure diversity of the culture strains community was relatively abundant,16 strains werePseudoalteromonasand related species,other strains were mainly distributed in 19 genuses.Among them,17 strains could produce extracellular proteolytic enzyme;20 strains could produce extracellular lipase;and strains NQ8 had strong antagonism to someVibrio.

green sea anemones;bacterial diversity;16S rRNA genes;phylogene;identification

Q93

A

0254-5071（2014）07-0135-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.031

2014-05-20

董雪敏（1985-），女，助理工程師，本科，研究方向?yàn)楹Ｑ笫称烽_(kāi)發(fā)利用和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定。

*通訊作者：叢培云（1962-），男，研究員，本科，研究方向?yàn)槭称窓z驗(yàn)。