張春梅，陳朝銀，趙聲蘭*，黃再強，樊啟猛（.云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，云南昆明650500；.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明650500）

核桃內(nèi)種皮多酚提取工藝及其體外抗氧化活性的初步研究

張春梅1，陳朝銀2，趙聲蘭1*，黃再強1，樊啟猛1
（1.云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，云南昆明650500；2.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明650500）

采用單因素試驗和正交試驗優(yōu)化核桃內(nèi)種皮多酚的回流提取工藝條件，采用清除羥自由基（·OH）、超氧陰離子（·O2-）、過氧化氫（H2O2）評價核桃內(nèi)種皮多酚的體外抗氧化活性。結(jié)果表明，核桃內(nèi)種皮多酚提取工藝條件：乙醇體積分數(shù)45%、液固比60:1 (mL∶g)、提取溫度70℃、提取時間60 min。在此條件下，多酚得率為25.05%。核桃內(nèi)種皮多酚具有顯著的清除·OH、·O2-和H2O2的能力，其中，當(dāng)質(zhì)量濃度為160 μg/mL時，對·OH的清除率達100%，優(yōu)于維生素C。

核桃內(nèi)種皮；多酚；提取工藝；抗氧化活性

核桃仁系胡桃科（Juglandaceae）植物胡桃（Juglans regial.）的成熟種子，《本草綱目》記載，核桃仁具有補氣養(yǎng)血、潤噪痰、益命門、利三焦等多種功效[1]。核桃仁作為一種傳統(tǒng)醫(yī)食兩用的健康食品[2]，越來越受到人們的廣泛關(guān)注。我國核桃種植資源非常豐富，研究表明，核桃除富含營養(yǎng)價值較高的蛋白質(zhì)和脂肪酸外，還含有大量的具有降血脂、降膽固醇、防止動脈粥樣硬化、延緩衰老等保健功能的多酚、黃酮、VE等[3-4]，核桃仁中對人體有益的多酚類物質(zhì)主要集中在種皮部分[5]，且核桃內(nèi)種皮中集中了核桃仁90%以上的抗氧化物質(zhì)[6]。本研究主要探討核桃內(nèi)種皮多酚的回流提取工藝及其提取物的體外抗氧化活性，為核桃內(nèi)種皮的進一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃內(nèi)種皮：產(chǎn)自云南漾濞的新鮮核桃，破殼取仁，趁鮮分離出核桃內(nèi)種皮，室溫條件下自然干燥，粉碎過20目篩。Folin-Ciocalteu試劑：北京索萊寶科技有限公司；沒食子酸對照品：西安開來生物工程有限公司；鄰苯三酚、鄰二氮菲、碳酸鈉、乙醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV759S紫外-可見分光光度計：上海精科儀器有限公司；CP214電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；HWS-18電熱恒溫水浴鍋：上海醫(yī)療器械五廠。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及多酚的測定[7]

稱取0.0050g沒食子酸對照品，于50mL容量瓶中用蒸餾水溶解并定容，得100 μg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，臨用現(xiàn)配。分別準(zhǔn)確吸取上述對照品溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL于10mL具塞試管內(nèi)，加水補足至1 mL，搖勻，加入5.0 mL 10%的Folin-Ciocalteu試劑，充分搖勻，5 min后加入7.5%碳酸鈉溶液4.0 mL，搖勻，25℃條件下避光放置反應(yīng)1 h，在波長765 nm處測吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，沒食子酸溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

按標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立方法，測定供試品溶液的吸光度值，通過沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的多酚含量（以沒食子酸計），多酚得率計算公式如下：

式中：m1為樣品中多酚的含量，g；m2為樣品質(zhì)量，g。

1.3.2 核桃內(nèi)種皮多酚提取工藝的優(yōu)化[8-9]

1）單因素試驗

A溫度的選擇：精密稱取0.2 g干燥的核桃內(nèi)種皮5份，分別按50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，在乙醇體積分數(shù)60%，液固比60∶1（mL∶g），提取時間60 min的條件下浸提2次，合并提取液，用Folin-Ciocalteu比色法測定多酚，研究不同提取溫度對多酚提取的影響。

B液固比的選擇：精密稱取0.2 g干燥的核桃內(nèi)種皮4份，按上述試驗確定的溫度，在乙醇體積分數(shù)60%的條件下，液固比（mL∶g）分別按40∶1、60∶1、80∶1、100∶1浸提2次，每次60 min，合并濾液，用Folin-Ciocalteu比色法測定多酚，研究不同液固比對多酚提取的影響。

C提取時間的選擇：分別精密稱取0.2 g干燥的核桃內(nèi)種皮5份，按乙醇體積分數(shù)60%、上述確定的提取溫度和液固比，分別提取30 min、60 min、90min、120min、150 min，浸提2次，合并濾液，用Folin-Ciocalteu比色法測定多酚含量，研究不同提取時間對多酚提取的影響。

D乙醇體積分數(shù)的選擇：分別稱取0.2 g干燥的核桃內(nèi)種皮5份，按上述確定的提取溫度、液固比和時間，選擇乙醇體積分數(shù)分別為40%、45%、60%、75%、90%，浸提2次，合并濾液，用Folin-Ciocalteu比色法測定多酚含量，研究不同乙醇體積分數(shù)對多酚提取的影響。

2）提取工藝優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗進行提取工藝的優(yōu)化。以乙醇體積分數(shù)（A）、提取時間（B）、液固比（C）、提取溫度（D）為考察因素，因素與水平見表1。

表1 核桃內(nèi)種皮多酚提取工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for polyphenols extraction process optimization from walnut kernel pellicle

1.3.3 核桃內(nèi)種皮多酚的體外抗氧化活性測定

1）對羥自由基（·OH）的清除作用[10]

采用Fention反應(yīng)體系，利用鄰二氮菲與Fe2+反應(yīng)生成有色配合物，該配合物在波長536 nm處有最大吸收的原理進行測定。H2O2/Fe體系產(chǎn)生的羥自由基（·OH）氧化鄰二氮菲-Fe2+生成鄰二氮菲-Fe3+，A536nm值減少，利用待測樣品對體系中·OH的清除作用，抑制A536nm減少，進而測定待測樣品對·OH的清除作用。

取10 mL具塞試管，以抗壞血酸（VC）為陽性對照，分別依次加入不同濃度核桃內(nèi)種皮多酚溶液（或等濃度VC溶液）1 mL，1 mL 0.75 mmol/L的FeSO4，1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲，1 mL 0.01%H2O2，37℃保溫1 h后，測定A536nm。損傷管和未損傷管不加抑制劑，損傷管含1 mL的H2O2，未損傷管不加H2O2。羥基自由基清除率計算公式：

式中：A0為試劑未損傷吸光度值；A1為試劑損傷管吸光度值；A2為樣品未損傷管吸光度值；A3為樣品損傷管吸光度值。

2）對超氧自由基（·O2-）的清除作用[11]

采用鄰苯三酚自氧化法，取10 mL具塞試管，依次加入50 mmol/L pH 8.2的Tris-HCl緩沖液1.5 mL，蒸餾水1.5 mL，搖勻，25℃恒溫20 min，取出，立即加入25℃預(yù)熱3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 mL，迅速混勻，在波長325 nm處每隔30 s測定1次吸光度值，計算線性范圍內(nèi)每1 min吸光度的增加值，即鄰苯三酚的自氧化速率ΔA對照。按上法在加入鄰苯三酚前，先加入一定量的核桃內(nèi)種皮多酚溶液，測定ΔA樣品。超氧自由基清除率計算公式：

式中：ΔA對照為1 min內(nèi)對照管吸光度的變化值；ΔA樣品為1 min內(nèi)對照管吸光度的變化值。

3）對過氧化氫（H2O2）的清除作用[12]

pH 7.4的磷酸鹽緩沖液配制的H2O2溶液在波長230 nm處有特征吸收，當(dāng)加入對H2O2有抑制作用的物質(zhì)時，溶液在波長230nm處的吸光度值減小，測定A230nm可計算對H2O2的清除率。

取10 mL的具塞試管，分別加入以50 mmol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液配制的40 mmol/L H2O2溶液2.4 mL，再加入不同濃度的核桃內(nèi)種皮多酚溶液（或VC溶液），用水補足至10 mL，混勻，10 min后測量A230nm。試驗中以不加樣品的H2O2溶液為空白對照，以不加H2O2溶液為樣品對照組。H2O2清除率計算公式：

式中：A0為空白對照組的吸光度值；A1為樣品組的吸光度值；A2為樣品對照組的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按1.3.1方法以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，沒食子酸質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，測得沒食子酸的線性回歸方程A=0.011 4C+ 0.018 9，回歸系數(shù)r=0.999 1，沒食子酸在質(zhì)量濃度為0～80 μg/mL內(nèi)，質(zhì)量濃度與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。2.2核桃內(nèi)種皮多酚提取工藝單因素試驗

2.2.1 溫度對核桃內(nèi)種皮多酚提取得率的影響

乙醇體積分數(shù)60%，液固比60∶1（mL∶g），提取時間60 min，提取溫度分別為50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，提取溫度對多酚得率的影響見圖1。

圖1 提取溫度對多酚得率的影響Fig.1 Effect of temperature on polyphenols extraction yield

由圖1可知，在試驗溫度范圍內(nèi)，隨著溫度增加，核桃內(nèi)種皮多酚的提取得率呈先增加后降低趨勢，溫度較低的情況下，多酚得率較低，當(dāng)溫度升高至80℃時，多酚提取率降低，可能是由于溫度過高，破壞了核桃內(nèi)種皮多酚。溫度70℃時，多酚得率最高，達24.63%，故采用70℃作為浸提的適宜溫度。

2.2.2 液固比對核桃內(nèi)種皮多酚得率的影響

乙醇體積分數(shù)60%，提取溫度70℃，時間60 min，液固比分別為40∶1、60∶1、80∶1、100∶1（mL∶g），液固比對多酚得率的影響見圖2。

圖2 固液比對多酚得率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on polyphenols extraction yield

由圖2可知，隨著液固比的增加，核桃內(nèi)種皮多酚的得率逐漸增加，當(dāng)液固比為60∶1（mL∶g）時，多酚得率為24.43%；當(dāng)液固比＞60∶1（mL∶g）時，多酚得率增加不多，故選擇60∶1（mL∶g）為最適液固比。

2.2.3 提取時間對核桃內(nèi)種皮多酚得率的影響

乙醇體積分數(shù)60%，提取溫度70℃，液固比60∶1（mL∶g），提取時間分別為30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，考察時間對多酚得率的影響見圖3。

圖3 提取時間對多酚得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on polyphenols extraction yield

由圖3可知，隨著提取時間增加，多酚得率呈先增后減的趨勢，提取時間較長，可能導(dǎo)致多酚物質(zhì)破壞，得率降低。60～120 min多酚得率變化不大，選擇60 min為適宜的提取時間。

2.2.4 乙醇體積分數(shù)對核桃內(nèi)種皮多酚得率的影響

提取溫度70℃，時間60 min，液固比60∶1（mL∶g），乙醇體積分數(shù)分別為40%、45%、60%、75%、90%，乙醇體積分數(shù)對多酚得率的影響見圖4。

圖4 乙醇體積分數(shù)對多酚得率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on polyphenols extraction yield

由圖4可知，乙醇體積分數(shù)為40%～45%時，隨乙醇體積分數(shù)的增加，多酚提取率增加，當(dāng)乙醇體積分數(shù)45%時，多酚得率為24.52%，乙醇體積分數(shù)為45%～60%時，多酚得率趨于平穩(wěn)。當(dāng)乙醇體積分數(shù)繼續(xù)升高時，得率反而降低，故選擇乙醇體積分數(shù)45%。

2.3 核桃內(nèi)種皮多酚提取工藝正交試驗

以乙醇體積分數(shù)、提取時間、液固比、提取溫度為因素，以多酚得率為考察指標(biāo)進行正交試驗，正交試驗結(jié)果見表2。

表2 核桃內(nèi)種皮多酚提取工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment for polyphenols extraction process optimization from walnut kernel pellicle

由表2可知，各因素的影響大小為提取溫度＞乙醇體積分數(shù)＞提取時間＞液固比，云南核桃內(nèi)種皮多酚的最佳提取條件為A1B2C2D1，即乙醇體積分數(shù)45%，提取時間60min，液固比60∶1（mL∶g），提取溫度70℃。

按最佳提取工藝A1B2C2D1進行驗證試驗，三次驗證試驗多酚平均得率為25.05%。

2.4 體外抗氧化試驗結(jié)果

2.4.1 對·OH的清除作用

由圖5可知，核桃內(nèi)種皮多酚及VC對·OH都具有清除作用，在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨質(zhì)量濃度增加，清除率上升，清除率與質(zhì)量濃度存在一定的量效關(guān)系，且核桃內(nèi)種皮多酚對·OH的清除率優(yōu)于VC。當(dāng)核桃內(nèi)種皮多酚質(zhì)量濃度為160 μg/mL時，對·OH清除率可達100%。

圖5 核桃內(nèi)種皮多酚對·OH的清除作用Fig.5 Effect of polyphenols from walnut kernel pellicle on·OH scavenging activity

2.4.2 對·O2-的清除作用

由圖6可知，核桃內(nèi)種皮多酚對·O2-有一定的清除作用，但核桃內(nèi)種皮多酚對鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的·O2-的清除作用不如VC。

圖6 核桃內(nèi)種皮多酚對·O2-的清除率Fig.6 Effect of polyphenols from walnut kernel pellicle on·O2-scavenging activity

2.4.3 對H2O2的清除作用

由圖7可知，在所考察的質(zhì)量濃度（5～35 μg/mL）范圍內(nèi)，核桃內(nèi)種皮多酚及VC對過氧化氫的清除作用隨其質(zhì)量濃度的增加不斷上升，但總的來說，核桃內(nèi)種皮多酚對H2O2的清除作用不如VC。

圖7 核桃內(nèi)種皮多酚對H2O2的清除作用Fig.7 Effect of polyphenols from walnut kernel pellicle on H2O2scavenging activity

3 結(jié)論

核桃內(nèi)種皮含有豐富的多酚類物質(zhì)，核桃內(nèi)種皮多酚的最佳提取條件為溫度70℃、時間60 min、液固比60∶1（mL∶g）、乙醇體積分數(shù)45%，且影響大小為：提取溫度＞乙醇體積分數(shù)＞提取時間＞液固比，在最佳提取工藝條件下，核桃內(nèi)種皮多酚得率為25.05%。核桃內(nèi)種皮多酚具有較強的清除羥自由基、超氧自由基及H2O2的活性，具有較好的開發(fā)應(yīng)用前景。

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Optimization of extraction technology andin vitroantioxidant activities of polyphenols from walnut kernel pellicle

ZHANG Chunmei1,CHEN Chaoyin2,ZHAO Shenglan1*,HUANG Zaiqiang1,FAN Qimeng1

(1.Faculty of Chinese Traditional Medicine,Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Kunming 650500,China; 2.Faculty of Life Science and Technology,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China)

Extraction technologyof polyphenols from walnut kernel pellicle was optimized by single-factor and orthogonal experiments.Meanwhile,the in vitroantioxidant activities of polyphenols from walnut kernel pellicle were evaluated by detecting hydroxyl radical(·OH),superoxide anion(·O2-) and hydrogen peroxide(H2O2)scavenging rates.Results showed that the optimized extraction conditions were as follows:ethanol concentration 45%, liquid-solid ratio 60∶1,temperature 70℃,and extraction time 60 min.Under such condition,the polyphenol extraction yield was 25.05%.Antioxidant experiments showed that polyphenols of walnut kernel pellicle had significant scavenging effect on·OH,·O2-and H2O2.When the polyphone concentration was 160 μg/ml,the·OH scavenging rate of polyphenols from walnut kernel pellicle was 100%,which was higher than vitamin C.

walnut kernel pellicle;polyphenols;extraction technology;antioxidant activities

R284.1

A

0254-5071（2014）07-0130-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.030

2014-05-06

科技部科技支撐計劃項目（2011BAD46B03、2011BAD46B02）；省科技計劃項目（2009EB081、2011AB006）；傣藥學(xué)、食品科學(xué)與工程學(xué)科建設(shè)項目（30970101808、3027010185）

張春梅（1989-），女，碩士研究生，研究方向為中藥資源開發(fā)與利用。

*通訊作者：趙聲蘭（1962-），女，教授，碩士，研究方向為藥食資源開發(fā)與利用。