劉德軍，彭旭東，王偉夫

（1.解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2解放軍總參謀部警衛(wèi)局保健處）

糖化血紅蛋白檢測(cè)方法與標(biāo)準(zhǔn)化

劉德軍1，彭旭東2，王偉夫2

（1.解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2解放軍總參謀部警衛(wèi)局保健處）

近年來(lái)，糖尿?。―M）的發(fā)病率呈不斷上升的趨勢(shì)，已成為威脅人民群眾健康的第三大慢病。中國(guó)20歲以上成年人的DM發(fā)病率已達(dá)到9.7%［1］，早期發(fā)現(xiàn)DM和血糖水平的控制顯得非常重要?？崭寡?、餐后血糖和葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）是國(guó)際上公認(rèn)的診斷DM的標(biāo)準(zhǔn)，但其只能反映瞬時(shí)血糖水平，容易受到各種因素的影響，糖化血紅蛋白（GHb）因其生物學(xué)特性，能夠反映最近2～3個(gè)月內(nèi)的平均血糖水平［2］，且不受空腹和胰島素治療的影響，因此它作為一個(gè)血糖監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)在臨床上得到廣泛應(yīng)用。2010年美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)（ADA）在《2010年糖尿病診療指南》中正式將糖化血紅蛋白（HbA1c）納入DM的診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］，現(xiàn)就GHb的臨床檢測(cè)方法與標(biāo)準(zhǔn)化作一綜述。

1 GHb的生化特性

GHb是指人體血液中結(jié)合了任何形式碳水化合物的血紅蛋白（Hb）。人類Hb可分為HbA（95%～97%）、HbA2（＜3%）、HbF（＜l%）。HbA中未結(jié)合糖類的為HbA0（90%）、結(jié)合糖的為HbAl（5%～7%）即GHb。HbA1c又可分為和HbA1a1、HbA1a2、HbA1b和HbAlc，HbAlc占GHb的70%～90%，其分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，組織中由葡萄糖的游離醛基與HbA的β鏈N末端纈氨酸進(jìn)行不可逆的非酶促反應(yīng)，稱為糖基化，GHb的形成主要取決于血糖濃度及血糖與Hb的接觸時(shí)間［2，4］，臨床上所測(cè)定的糖化血紅蛋白主要指HbAlc。

2 HbA1c檢測(cè)方法

HbA1c的檢測(cè)方法按其理化性質(zhì)可分為兩大類：一類是基于糖化與非糖化Hb所帶電荷不同，如離子交換層析法、電泳法；另一類是基于Hb上糖化基團(tuán)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，如親和層析法、免疫法和酶法［5-6］。不同檢測(cè)方法的結(jié)果存在差別，而糖尿病的診斷與血糖監(jiān)測(cè)要求測(cè)定值不受檢測(cè)方法的影響，因此不同檢測(cè)方法結(jié)果的可比性和標(biāo)準(zhǔn)化非常重要［7］。

2.1 離子交換層析法 主要有高效液相色譜法（HPLC），低效液相色譜法（LPLC）和手工微柱，廣泛采用的是HPLC。此方法是基于血紅蛋白β鏈N末端纈氨酸糖化后所帶電荷不同而建立，應(yīng)用弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，HbAlc由于所帶正電荷相對(duì)較少，在選定的低濃度洗脫液和接近中性的pH條件下，HbAlc首先被洗脫，從而與HbAla、HbAlb、HbF、不明蛋白組分、蛋白組分3、不穩(wěn)定GHb及HbS等分離［8］。所得到的的層析譜橫坐標(biāo)是時(shí)間，縱坐標(biāo)是百分比。HbAlc的值以HbA1c峰面積占Hb總面積的百分比來(lái)表示。此方法測(cè)定的HbAlc結(jié)果精確，準(zhǔn)確性和重復(fù)性高。美國(guó)臨床化學(xué)協(xié)會(huì)（AACC）、糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)化分會(huì)和國(guó)際臨床化學(xué)和實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)聯(lián)盟（IFCC）HbAlc標(biāo)準(zhǔn)化工作組建議，將HPLC方法作為檢測(cè)HbA1c的金標(biāo)準(zhǔn)［9］。雖然HPLC方法具有精度高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但其易受HbA1c前體、甲酰化或乙?；疕b、胎兒血紅蛋白（HbF）及變異血紅蛋白（HbS、HbE、HbC、HbD）的干擾，并受外界環(huán)境溫度的影響。在某些疾病情況下（如貧血、白血病、珠蛋白生成障礙性貧血、遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)癥）HbF會(huì)異常升高，從而使結(jié)果產(chǎn)生偏差［10］。

2.2 電泳法 電泳法是基于糖化和非糖化Hb所帶電荷不同，于酸性緩沖液條件下（pH6.0）在瓊脂糖凝膠上泳動(dòng)速度不同進(jìn)行分離檢測(cè)。電泳結(jié)束后，Hb各組分從負(fù)極到正極分別是HbA1a、HbA1b、HbAlc、HbA0，通過(guò)吸光度掃描，可計(jì)算得出HbA1c的百分含量。Doelman等［11］采用毛細(xì)管電泳法測(cè)定HbA1c，其結(jié)果不受氨基甲?；约耙阴b變異體的影響，其他Hb變異體（HbS、HbE、HbC、HbD）也不干擾本方法的準(zhǔn)確性。該方法的缺點(diǎn)是速度較慢，自動(dòng)化程度低，所測(cè)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)員對(duì)電泳波峰的判斷有關(guān)，且設(shè)備費(fèi)用昂貴，目前主要用于GHb的研究。

2.3 親和層析法 親和層析法利用硼酸鹽與整合在Hb上的葡萄糖順位二醇基可逆結(jié)合的特性，由Mallia等［12］于1981年研發(fā)的。通常使用間-氨基苯硼酸瓊脂糖，將血樣本加到層析柱后，所有的GHb與硼酸結(jié)合留在柱中，非GHb直接被洗出層析柱；再加入高濃度也包含順位二醇基的多羥基復(fù)合物（如山梨醇），GHb與硼酸的結(jié)合被山梨醇替換并被洗脫下來(lái)，分別測(cè)量?jī)山M分，并計(jì)算比值。該方法具有操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、精度較高且不受Hb變異體影響等優(yōu)點(diǎn)［9］。該方法目前可以標(biāo)準(zhǔn)化，且與HPLC有良好的相關(guān)性，比較適用于臨床監(jiān)測(cè)。

2.4 免疫法 免疫法利用抗原-抗體特異性反應(yīng)原理，將HbA1c的β鏈N末端最初的4～8個(gè)氨基酸作為抗體識(shí)別位點(diǎn)，制備相應(yīng)的單克隆抗體，血樣本中的HbA1c與相應(yīng)的單克隆抗體發(fā)生凝集反應(yīng)，通過(guò)比色或比濁法測(cè)定HbA1c的含量。測(cè)定完HbA1c的含量后還需檢測(cè)Hb總量，從而計(jì)算出HbA1c的百分比。該方法快速、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，可在全自動(dòng)生化儀上測(cè)定，不用另外購(gòu)置儀器。近來(lái)發(fā)現(xiàn)變異血紅蛋白可影響檢測(cè)結(jié)果，且此方法受高血糖、三酰甘油、膽紅素的干擾。此外，在高濃度樣本的檢測(cè)中結(jié)果偏低，與抗體濃度不能達(dá)到相應(yīng)高度有關(guān)。

2.5 酶法 血樣本經(jīng)溶血處理后，由蛋白酶消化處理，糖基化的纈氨酸被釋放出來(lái)，作為果糖基纈氨酸氧化酶的底物，被氧化產(chǎn)生H2O2。H2O2的濃度與血樣本中HbAlc的含量成正比，在過(guò)氧化物酶催化下，與特定的色原耦聯(lián)，根據(jù)顏色變化程度可得H2O2的濃度，從而計(jì)算出HbAlc的含量，同時(shí)測(cè)定總Hb的濃度，計(jì)算HbAlc與Hb的濃度比值，得出HbA1c的百分比［13］。酶法檢測(cè)HbAlc可應(yīng)用于自動(dòng)生化分析儀，具有操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速、重復(fù)性好，特異性高等特點(diǎn)。檢測(cè)中處理后的血樣本與氧化還原劑反應(yīng)，減少了小分子和高分子物質(zhì)的干擾［14］。與作為金標(biāo)準(zhǔn)的HPLC法相比，測(cè)定結(jié)果具有良好的相關(guān)性［13］。

3 HbA1c檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化

實(shí)驗(yàn)室中常用的HbAlc檢測(cè)方法因所用原理不同，加上各種因素的影響，使測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、穩(wěn)定性都有所差異，導(dǎo)致各實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果缺乏可比性，對(duì)HbA1c在臨床上的應(yīng)用制造了障礙。

為解決HbA1c檢測(cè)結(jié)果可比性的問(wèn)題，1984年P(guān)eterson等［15］首次提出檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題，對(duì)實(shí)驗(yàn)室間各種方法的可比性和重復(fù)性進(jìn)行了評(píng)估。1995年國(guó)際臨床化學(xué)協(xié)會(huì)（IFCC）成立了HbAlc標(biāo)準(zhǔn)化工作組，并于2002年發(fā)表了HbAlc的參考檢測(cè)體系［16］。新的參考體系形成了一個(gè)國(guó)際化的標(biāo)準(zhǔn)，2007年5月由美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)、歐洲糖尿病研究協(xié)會(huì)、國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)和IFCC提出共同協(xié)議，將在世界范圍內(nèi)形成HbAlc檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化，并采用IFCC單位（mmol／mol）和美國(guó)國(guó)家糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)劃（NGSP）單位（%）共同報(bào)告HbAlc結(jié)果［17］。

我國(guó)HbAlc測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)化工作還處于起步階段。雖然早在2010年ADA已正式將HbAlc納入糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，但我國(guó)的指南卻遲遲未將HbAlc寫入指南，主要還是由于我國(guó)很多地區(qū)HbAlc檢測(cè)尚不普遍，不同實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果缺乏可比性。王冬環(huán)等［18］的研究顯示，同一方法在不同實(shí)驗(yàn)室間的變異系數(shù)在10%甚至20%以上，距離國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)5%還有很大差距，使得HbA1在我國(guó)應(yīng)用于糖尿病的篩查、診斷、監(jiān)測(cè)上的效果大打折扣。我國(guó)為糖尿病大國(guó)，糖尿病患患者數(shù)已達(dá)9200萬(wàn)，居世界首位，同時(shí)還有糖尿病前期患者1.48億［1］。為提高我國(guó)糖尿病患者的篩查、診斷、監(jiān)測(cè)和治療水平，盡早與國(guó)際接軌，建立起全國(guó)性的HbAlc檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化是擺在我們醫(yī)務(wù)工作者面前的一項(xiàng)重要工作。

［1］ Yang W，Lu J，Weng J，et al.Prevalence of diabetes amongmen and women in china［J］.N Engl JMed，2010，362（12）：1090-1101.

［2］ 周新，涂植光.臨床生物物化學(xué)和生物化學(xué)檢驗(yàn)［M］.3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：89.

［3］ American Diabetes Association.Diagnosis and classification of diabetes mellitus［J］.Diab Car，2013，34（Suppl 1）：62-69.

［4］ King H，Aubert RE，HermanWH.Global burden of diabetes，1995-2025：prevalence，numerical estimates，and projections［J］.Diabetes Care，1998，21（9）：1414-1431.

［5］ Godall I，Colman PG，Schneider HG.et al.Desirable performance standards for HbA1c analysis-precision，accuracy and standardization：consensus statement of the Australasian Association of Clinical Biochemists（AACB），the Australian Diabetes Society（ADS），the Royal College of Pathologists of Australasia（RCPA），Endocrine Society of Australia（ESA），and the Australian Diabetes Educators Association（ADEA）［J］.Clin Chem Lab Med，2007，45（8）：1083，1097.

［6］ Bry L，Chen PC，Sacks DB.Effects of hemoglobin variants and chemically modified derivatives on assays for glyhemoglobin［J］.Clin Chem，2001，47（2）：153-163.

［7］ 王虹，高穎，梁紅，等.應(yīng)用兩種方法檢測(cè)糖化血紅蛋白結(jié)果的比較［J］.醫(yī)藥世界，2006，7（7）：82-83.

［8］ 姜玉章，季蘇琴，殷先德，等.糖化血紅蛋白不同組分的臨床價(jià)值探討［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2008，23（4）：354-356.

［9］ Little RR，Rohlfing CL，Wiedmeyer HM，et al.The national glycohemoglobin standardization program：a five-year progress report［J］.Clin Chem，2001，47（11）：1985-1992.

［10］Bunn HF.Forget BG.Hemoglobin：molecular，genetic and clinical aspects［J］.Philadelphia：WB Saunders Co，1986：425-427.

［11］Doelman CJ，Siebelder CW，NijhofWA，et al.Capillary electrophoresis system for hemoglobin A1c determinations evaluated［J］.Clin Chem，1997，43（4）：644-648.

［12］Mallia AK，Hermanson GJ，Krohn RI，et al.Preparation and use of a boronic acid affinity spport for separation and quantization of glycosylated hemoglobins［J］.Anal Lett，1981，14（B8）：649-661.

［13］Liu L，Hood S，Wang Y，et al.Direct enzymatic assay for %HbA1c in human whole blood samples［J］.Clin Biochem，2008，41（7／8）：576-583.

［14］段桂萍，王靜.糖化血紅蛋白直接酶法測(cè)定自動(dòng)化分析的應(yīng)用［J］.中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2009，4（24）：216-217.

［15］Peterson CM，Jovanovic L，Raskin P，et a1.A comparative evaluation of glyemyhted hemoglobin assays：feasibility of references and standards［J］.Diabetologia，1984，26（3）：214-217.

［16］International Organization for Standardization.ISO 17511.In vitro diagnostic medical devices-measurement of quantities in samples of biological origin-metrological traceability of values assigned to calibrators and controlmaterial［R］.Geneva：ISO，2003.

［17］Consensus Committee.Consensus statement on tlle world wide standardization of the hemogiobin aicmeasurement：the american diabetes association，european association for the study of diabetes，international federation of clinical chemistry and labora ory medicine，and the international diabetes federation［J］.Diabetes Care，2007，30（9）：2399-2400.

［18］王冬環(huán)，張傳寶，陳文祥，等.應(yīng)重視糖化血紅蛋白測(cè)定技術(shù)及量值溯源［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2008，31（9）：965-968.

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10.3969／J.issn.1672-6790.2014.06.041

2014-08-11）

劉德軍，主任醫(yī)師，Email：liudejun6721＠126.com