徐汪洋

廣東省第二人民醫(yī)院，廣東 廣州 510317

實(shí)驗(yàn)研究

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠脊髓損傷后BDNF與GAP 43基因表達(dá)的干預(yù)探索

徐汪洋

廣東省第二人民醫(yī)院，廣東 廣州 510317

目的了解骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）移植對(duì)大鼠脊髓損傷（SCI）后腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）與神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白質(zhì)（GAP 43）基因表達(dá)的干預(yù)。

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；脊髓損傷；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白質(zhì)

一直以來(lái)，在神經(jīng)科領(lǐng)域脊髓損傷后再生修復(fù)研究是其中的重要課題。根據(jù)相關(guān)的研究報(bào)道顯示，在特定條件作用下，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞能夠分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞或者神經(jīng)細(xì)胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)植入MSCs，可以促使其得到進(jìn)一步的分化，整合宿主神經(jīng)元，產(chǎn)生髓鞘，其作用顯著［1］。本文主要研究骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠脊髓損傷后GAP-43與BDNF基因表達(dá)的干預(yù)，相關(guān)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 本組選擇100只Wistar品系大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，其中6只為6～8周齡SD品系大鼠，采用DMEM/F12（1：1）培養(yǎng)液（購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司），選用胰蛋白酶（購(gòu)自上海第一生化藥業(yè)有限公司）﹑胎牛血清（購(gòu)自上海韻涵生物科技有限公司）﹑B27；SABC試劑盒與抗巢蛋白抗體 （購(gòu)自上海億欣生物科技有限公司）；PCR反應(yīng)試劑盒與mRNA提取試劑盒（購(gòu)自上海研卉生物科技有限公司）。

1.2 分離﹑培養(yǎng)與鑒定MSCs 在無(wú)菌基礎(chǔ)上，將大鼠的股骨與脛骨進(jìn)行分離，同時(shí)去掉兩端的骨骺，使骨髓腔暴露，采用D-Hanks液清洗骨髓腔，并留置骨髓細(xì)胞的懸浮液體備用。接種工具為塑料培養(yǎng)瓶，溫度調(diào)整為37℃，采用濃度為5%的二氧化碳來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)，于72 h后置換半量液體，繼后每相隔72 h進(jìn)行一次全量換液處理。于12 d左右，當(dāng)細(xì)胞處于融合狀態(tài)下，要清洗PBS，持續(xù)3次后置入濃度為0.0125%的胰酶，待消化時(shí)間達(dá)到2 min后采用濃度為10%的FBS停止培養(yǎng)液消化，收集懸液，采用1：3接種方式，移植細(xì)胞取為1×107/μI。選取CD44與CD34標(biāo)記物來(lái)進(jìn)行鑒定，排除造血干細(xì)胞。

1.3 制作SCI動(dòng)物模型 麻醉雄性大鼠，運(yùn)用AIIenA打擊裝置，損傷標(biāo)準(zhǔn)主要有三個(gè)方面：一是T10脊髓損傷，二是鼠尾出現(xiàn)痙攣性擺動(dòng)，三是雙下肢癱。繼后開始縫合，于皮下加入慶大霉素，術(shù)后予以擠尿處理。于大鼠MSCs后第7 d，其MSCs處處于空洞狀況下分組觀察，MSCs移植組取36只，DMEM填充組取36只，注入5 L培養(yǎng)液，對(duì)照組取28只，不作脊髓損傷處理。結(jié)合抗生素，于移植術(shù)后7 d內(nèi)行腹腔注射。

1.4 BDNFmRNA與GAP-43mRNA表達(dá)分析 移植術(shù)后MSCs移植組與DMEM填充組分別于1 d﹑3 d后處死大鼠，取損傷節(jié)段脊髓；對(duì)照組于5 d后處死大鼠，取相應(yīng)脊髓。提取總mRNA，采用逆轉(zhuǎn)錄法進(jìn)行cDNA的合成，進(jìn)而擴(kuò)增PC，分析引物序列，觀察預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度變化?；陔娪緺顟B(tài)下，運(yùn)用計(jì)算機(jī)圖像分析儀對(duì)RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行掃描，結(jié)合凝膠圖像分析系統(tǒng)，對(duì)RT-PCR產(chǎn)物電泳條行光密度檢查，繼后定量BDNFmRNA與GAP-43 mRNA與表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)上述資料進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05時(shí)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

經(jīng)由MSCs培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，原代細(xì)胞貼壁部分較少，于12 d左右在集落間發(fā)生融合作用，最終形成單層，細(xì)胞體細(xì)長(zhǎng)，其形態(tài)與成纖維細(xì)胞相似?；趥鞔螖?shù)持續(xù)增加狀況下，其細(xì)胞貼壁分布較為均勻，形態(tài)發(fā)展形似，主要為梭形，且胞體相對(duì)飽滿，細(xì)胞增殖與傳代較為穩(wěn)定。對(duì)照組成年大鼠BDNFmRNA表達(dá)量低下，GAP-43 mRNA呈弱表達(dá)。移植術(shù)后24 h，MSCs移植組與DMEM填充組均發(fā)現(xiàn)BDNFmRNA與GAP-43 mRNA表達(dá)，MSCs移植組表達(dá)量高于DMEM填充組（P<0.05），BDNFmRNA表達(dá)增加了22%左右，GAP-43 mRNA表達(dá)增加了20%左右。于移植術(shù)后72 h，兩組的BDNFmRNA與GAP-43 mRNA表達(dá)量均處于上升趨勢(shì)，且前者BDNFmRNA表達(dá)量較后者平均提升了26%左右（P<0.05），GAP-43 mRNA表達(dá)平均提升了26%左右（P<0.05）。在移植術(shù)后第7 d，DMEM填充組兩種表達(dá)量均出現(xiàn)下降，而MSCs移植組處于增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)。

3 結(jié)論

脊髓損傷根治關(guān)鍵在于神經(jīng)元再生能力的恢復(fù)，臨床上主要在脊髓損傷處植入組織進(jìn)行治療。MSCs作為一種非造血組織干細(xì)胞，自我更新能力﹑增殖能力與貼壁能力強(qiáng)，可以收集MSCs懸液，同時(shí)多向分化功能優(yōu)越，一定條件下可以分化成軟骨細(xì)胞﹑成骨細(xì)胞﹑肌細(xì)胞﹑脂肪細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞，可移植性優(yōu)越［2，3］。在動(dòng)物損傷脊髓內(nèi)植入MSCs，經(jīng)由組織學(xué)發(fā)現(xiàn)其與星形膠質(zhì)細(xì)胞有關(guān)，可構(gòu)建橋聯(lián)結(jié)，可見(jiàn)神經(jīng)纖維，基于體外誘導(dǎo)分化劑推動(dòng)下，可進(jìn)行神經(jīng)元特異性標(biāo)志物的表達(dá)，治療脊髓損傷具有可行性，但治療機(jī)制尚不明確［4］。

腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子作為一種小分子蛋白質(zhì)，與神經(jīng)生長(zhǎng)因子具有同源性，對(duì)神經(jīng)元生存﹑分化與神經(jīng)元維持等方面起著至關(guān)重要的作業(yè)，抗損傷性刺激作用顯著，能夠推動(dòng)神經(jīng)元的再生，保護(hù)神經(jīng)元功能，預(yù)防神經(jīng)元細(xì)胞病變。根據(jù)相關(guān)研究顯示，采用BDNF基因與NGF基因?qū)MSCs進(jìn)行修飾，經(jīng)由靜脈移植促使其進(jìn)入SCI區(qū)，可分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，預(yù)防脊髓繼發(fā)損傷［5］。GAP 43是一種胞膜磷酸蛋白質(zhì)，主要分布于神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等處，神經(jīng)元促生功能顯著，已經(jīng)成為了神經(jīng)發(fā)育﹑突觸重建與軸突再生的可塑性特異性標(biāo)志。臨床上神經(jīng)再生主要顯示為GAP-43基因高表達(dá)，與脊髓再生具有密切的關(guān)聯(lián)性。通常SCI后其GAP-43表達(dá)將會(huì)增加，表明其再生作用顯著。基于外源性營(yíng)養(yǎng)因子缺乏狀況下，GAP-43可以使神經(jīng)長(zhǎng)出新突起，提升神經(jīng)可塑性，實(shí)現(xiàn)突觸重構(gòu)與遞質(zhì)釋放。在本文研究顯示，經(jīng)由MSCs移植后GAP-43基因與BDNF早期表達(dá)顯著增強(qiáng)，表明脊髓損傷修復(fù)速度快，這與相關(guān)研究報(bào)道具有一致性。

綜上所述，MSCs移植可顯著增加BDNFmRNA與GAP-43 mRNA表達(dá)水平，其脊髓損傷修復(fù)作用值得臨床應(yīng)用。

［1］智春升，謝林.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠脊髓損傷后BDNF與GAP-43基因表達(dá)的影響.中國(guó)矯形外科雜志，2009（18）：1404-1406.

［2］鄧?yán)?，楊朝鮮，涂江義，等.移植膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因修飾骨髓基質(zhì)干細(xì)胞對(duì)腦出血大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2010（14）： 2583-2587.

［3］陳良，劉陽(yáng).骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠脊髓損傷區(qū)NGF與BDNF表達(dá)的影響.四川醫(yī)學(xué)，2011（03）：320-323.

［4］賈宏偉，李艷英.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合吡拉西坦修復(fù)大鼠脊髓損傷. 中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2011（10）：1783-1788.

［5］劉志剛，鄭啟新,熊敏.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合孕酮應(yīng)用對(duì)脊髓損傷的修復(fù)作用.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2012（03）：296-302.

R295.6

A

1674-9316（2014）04-0093-02

10.3969/J.ISSN.1674-9316.2014.04.058

方法大鼠脊髓損傷后第7 d經(jīng)肋間后動(dòng)脈介入植入MSCs，基于無(wú)菌條件下，實(shí)驗(yàn)分成三組，即MSCs移植組（36例）、DMEM填充組（36例）以及正常對(duì)照組（28例），采用RT-PCR法分析MSCs移植后GAP-43與BDNF基因表達(dá)變化狀況。

結(jié)果針對(duì)BDNFmRNA與GAP-43 mRNA表達(dá)水平而言，MSCs移植組上升程度明顯高于單純損傷組。

結(jié)論基于MSCs移植作用下，脊髓損傷區(qū)的環(huán)境得到了明顯的改善,增加BDNFmRNA與GAP-43 mRNA的表達(dá)水平,其脊髓損傷修復(fù)作用顯著。