王曉琴，李方友，高旭峰，鄭秀芳，金有銀，盧雅蘭，張芬琴*

（河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅 張掖 734000）

黃參是傘形科迷果芹（Sphallerocarpus gracilis）的肉質(zhì)根莖，俗稱野胡蘿卜，黃參富含蛋白質(zhì)、黃酮、多糖和類胡蘿卜素及人體必需的多種氨基酸和豐富的礦質(zhì)元素[1-2]；黃參是一種藥食兼用的極具開發(fā)前景的特色野生植物資源，不僅有獨(dú)特的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)，而且還有一定的保健和療效作用[3-7]。胡蘿卜具有“小人參”之美稱，通常為一年生，傘形科草本植物[8]。胡蘿卜營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，來源廣泛且價(jià)格低廉，含有豐富的β-胡蘿卜素（即VA原）、鋅、鐵、鈣等元素和膳食纖維[9]。胡蘿卜具有許多功效，如益肝明目、通便、防癌、降壓降脂和增加人體免疫力等[10-12]。它是一種對(duì)人體健康非常有益的食品[9]。

凝固型酸乳以口感好、酸甜可口、營(yíng)養(yǎng)豐富被廣大消費(fèi)者認(rèn)可。近年來，研究者們將一些功能性配料添入凝固型酸乳中，開發(fā)出營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高的新型酸乳。如權(quán)美平[13]研發(fā)了添加杏仁等的酸乳，陶偉雙等[14]研發(fā)了添加銀耳的酸乳，陳默等[15]研發(fā)了添加山藥的酸乳，王蔚新等[16]研發(fā)了添加大豆的凝固型酸乳。這些添加物不僅拓寬了酸乳的花色品種，而且增強(qiáng)了傳統(tǒng)酸乳的營(yíng)養(yǎng)，具有很好的保健作用。

本實(shí)驗(yàn)以黃參和胡蘿卜為材料，采用Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)、Box-Behnke試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)黃參胡蘿卜凝固型復(fù)合酸乳工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化；對(duì)影響酸乳口感的關(guān)鍵因素進(jìn)行了研究，從而確定酸乳的原料要求，既能節(jié)約生產(chǎn)成本，又不影響酸乳口感；促進(jìn)黃參和胡蘿卜復(fù)合功能食品加工可持續(xù)發(fā)展，此產(chǎn)品不僅豐富了市場(chǎng)酸乳制品的花色，并且為胡蘿卜和黃參的發(fā)展提供了新的途徑；為河西地區(qū)乳品企業(yè)產(chǎn)品創(chuàng)新、拓寬酸乳的品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃參采樣于甘肅山丹縣；永昌胡蘿卜選用新鮮、勻稱、顏色鮮亮、肉厚、飽滿、無(wú)蟲蛀、無(wú)明顯溝痕和分叉的新鮮胡蘿卜；保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus，Lb.）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus，St.）混合菌種（1∶1）由河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室經(jīng)試驗(yàn)篩選、培養(yǎng)馴化而得；鮮牛乳 甘肅省張掖市鑫源乳業(yè)公司；蔗糖、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、黃原膠均為食品級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-220型冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；CL-30L全自動(dòng)高壓滅菌鍋 日本ALP公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司；PHS-2F數(shù)字pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；A-260蓋勃氏乳脂計(jì) 滄州高密分析儀器廠；AE200電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；MJX-160恒溫培養(yǎng)箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SW-CJ-ID超凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備廠；SMART光學(xué)顯微鏡 北京泰克儀器有限公司；SY-6型榨汁機(jī) 九陽(yáng)股份有限公司；OSU-4L脈沖電場(chǎng)殺菌設(shè)備 美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)。

1.3 方法

1.3.1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table1 Factors and levels used for Plackett-Burman design

采用Plackett-Burman兩水平法對(duì)影響黃參胡蘿卜凝固型復(fù)合酸乳發(fā)酵的8個(gè)因素進(jìn)行考察，每個(gè)因子取高（1）和低（－1）2個(gè)水平，響應(yīng)值為沉淀率（Y）。篩選影響黃參胡蘿卜凝固型復(fù)合酸乳沉淀率的主效因素，試驗(yàn)因素水平及編碼見表1。

1.3.2 最陡爬坡試驗(yàn)

響應(yīng)面擬合方程只有在考察的鄰近區(qū)域里才能充分近似真實(shí)情況，所以先逼近最大沉淀率區(qū)域后才能建立有效的擬合方程。根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出顯著因子，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，以期尋找到沉淀率。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理[17-18]，對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)確定的主效因和最陡爬坡試驗(yàn)確定的因素水平的中心點(diǎn)，取三水平作相互作用，確定最優(yōu)組合，試驗(yàn)因素水平及編碼見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平及編碼表Table2 Codes and levels of factors used for Box-Behnken design

1.3.4 工藝流程

胡蘿卜→清洗→切片→護(hù)色→榨汁→過濾→胡蘿卜汁 黃參漿←過濾無(wú)菌灌裝←打漿←去皮←滅菌←選料←黃參

鮮牛奶→預(yù)熱→加糖→混合調(diào)料（胡蘿卜汁、黃參漿）→滅菌（90℃、5 min）→冷卻→接種（加入發(fā)酵劑←擴(kuò)大←活化←菌種）→無(wú)菌灌裝（殺菌后無(wú)菌灌裝至已滅菌的玻璃瓶?jī)?nèi)）→保溫發(fā)酵→冷卻后酵（24 h）→成品→檢驗(yàn)

1.3.5 胡蘿卜汁的制備

選取新鮮、勻稱、顏色鮮亮、無(wú)蟲蛀、無(wú)明顯溝痕和分叉的新鮮胡蘿卜，用流水沖洗去除泥土等雜質(zhì)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%氫氧化鈉溶液（90℃）浸泡1～2 min[19]，后置于流動(dòng)清水中清洗，用pH值試紙測(cè)試呈中性為止。將胡蘿卜切分成0.5～1 cm厚的薄片，按料液比1∶3（m/V）護(hù)色（用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.03%抗壞血酸），漂燙5 min，待降溫至60～70℃榨汁。將榨出的汁液用8 層無(wú)菌脫脂紗布過濾2次，在4 000 r/min條件下離心15 min，分離漿液后，取上清液，冷藏備用。

1.3.6 黃參漿的制備

參照文獻(xiàn)[20]選取無(wú)明顯溝痕、完整干凈的新鮮黃參，快速用流水沖洗干凈。在相對(duì)于黃參體積10倍的蒸餾水中將質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的白砂糖溶解，再將黃參浸入其中，用封口膜封好；85℃高壓蒸煮，20 min后去皮榨漿備用。

1.3.7 發(fā)酵劑的制備

以體積分?jǐn)?shù)3%～4%的比例將保存的液體菌種接入滅菌乳中，42℃培養(yǎng)12～24 h，冷卻后置于4℃冰箱中保存。傳代3次，菌種可達(dá)正?；盍?，制得母發(fā)酵劑，冷藏備用。

1.3.8 菌種馴化

將活化后的混合菌種接種于胡蘿卜汁和黃參漿1∶2（m/m）再加鮮牛奶的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度39℃、培養(yǎng)時(shí)間6 h逐步馴化（三代）后，穩(wěn)定提高菌種活力，繁殖速度加快，即進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.3.9 黃參胡蘿卜凝固型復(fù)合酸乳的工藝操作要點(diǎn)

1.3.9.1 預(yù)熱、調(diào)配、滅菌及接種

將檢驗(yàn)合格的原料乳預(yù)熱至60℃時(shí)加入6%～8%的白砂糖，加熱至90～95℃，保溫5 min。降溫至70℃，攪拌后加入黃參漿和胡蘿卜汁，再攪拌，繼續(xù)加熱至70℃后保持2 min；降溫至45℃，在無(wú)菌條件下，將發(fā)酵劑充分?jǐn)噭虬唇臃N量為3%～5%加到混合乳中，攪拌5 min均勻，灌裝發(fā)酵。

1.3.9.2 保溫發(fā)酵及冷藏

在43℃條件下進(jìn)行保溫發(fā)酵，待完全凝乳后停止發(fā)酵，將發(fā)酵后的產(chǎn)品迅速冷卻至10℃以下，然后置于0～4℃的環(huán)境中后發(fā)酵24 h，經(jīng)檢驗(yàn)合格后即為成品。

1.3.10 測(cè)定方法

乳酸菌計(jì)數(shù)：按GB/T 4789.35—2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)：食品中乳酸菌檢驗(yàn)》規(guī)定的方法檢驗(yàn)[21]。

總固形物、酸度、脂肪：按GB/T 5413.39—2010《乳與乳制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》規(guī)定的方法檢驗(yàn)[22]；蛋白質(zhì)：按GB/T 5009.52—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》規(guī)定的方法檢驗(yàn)[23]。

持水力：取5 mL的樣品離心后除去上清液，使離心管保持倒置狀態(tài)10 min。結(jié)束后立即稱量[24]。計(jì)算公式如下：

沉淀率的測(cè)定[25]：準(zhǔn)確稱取樣液5 mL于離心管中，3 000 r/ min離心10 min，去除上清液，準(zhǔn)確稱取沉淀質(zhì)量，計(jì)算沉淀率，公式如下：

1.3.11 微生物指標(biāo)檢測(cè)

大腸菌群和致病菌：按GB/T 19302—2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢測(cè)：乳與乳制品檢驗(yàn)》規(guī)定的方法檢驗(yàn)[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 影響黃參胡蘿卜凝固型復(fù)合酸乳發(fā)酵重要影響因素的篩選

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。利用軟件Design-Expert 8.0.5.0對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，各因素的影響效果見表3，由表3可見，x5（黃參漿添加量）、x2（胡蘿卜汁添加量）、x6（加糖量）和x7（發(fā)酵劑添加量）對(duì)沉淀率的影響最為顯著，而且4個(gè)因素的效應(yīng)值為正，而其他因素對(duì)沉淀率影響較小，故在下一步響應(yīng)面分析中只考察4個(gè)因素最優(yōu)水平。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table3 Design and results of Plackett-Burman experiments

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)確定因素水平

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)參數(shù)估計(jì)表Table4 Coefficient estimates of PB design

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table5 Results of steepest ascent design%

由表4關(guān)鍵因素效應(yīng)可以看出，要使黃參胡蘿卜凝固型復(fù)合酸乳穩(wěn)定、感官質(zhì)量好、沉淀率最佳[27-28]，應(yīng)該提高黃參漿添加量、胡蘿卜汁添加量、加糖量和接種量，沉淀率可以快速、準(zhǔn)確地判斷所添加穩(wěn)定劑的含量在含乳飲料體系中應(yīng)用的可行性，為生產(chǎn)和科研提供理論依據(jù)[29]。根據(jù)上述4個(gè)關(guān)鍵因素效應(yīng)的大小比例設(shè)定它們的變化方向及步長(zhǎng)進(jìn)行的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5，隨著4個(gè)重要因素的不同變化，沉淀率的變化趨勢(shì)是先上升后下降，其中在3號(hào)水平上達(dá)到最大值，由此可知，最佳沉淀率分在3號(hào)水平附近，選此水平為中心點(diǎn)作為后續(xù)的響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

2.3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

取爬坡試驗(yàn)表5中的3號(hào)試驗(yàn)條件作為響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平的中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。以四因素三水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6。

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table6 Design and results of Box-Behnken experiments

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)中對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合的二次模型方差分析見表7，回歸方程中各變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性由P值來判定，概率P值越小，則相應(yīng)變量的顯著性越高[30]。利用軟件Design-Expert 8.0.5.0對(duì)表中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到編碼空間二次函數(shù)模型為：Y=44.49+0.052A－2.89B－1.96C+0.32D－0.38AB－2.74AC－3.04BC－9.89A2－12.10B2－8.88C2－9.06D2，方差分析及F檢驗(yàn)結(jié)果列于表8。

表7 Box-Behnken試驗(yàn)方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table7 Significance test and variance analysis of Box-Behnken experiments

表8 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table8 Significance test for each item in the regression model

多元回歸模型擬合度采用R2表示，以R2＞0.9判定為優(yōu)[31]。軟件分析的多元擬合系數(shù)為R2=0.986 6，說明模型對(duì)試驗(yàn)實(shí)際情況擬合較好；預(yù)測(cè)R2=0.929 9，模型的校正決定系數(shù)R2=0.973 2，說明該模型能解釋97.32%響應(yīng)值的變化；由表7可知，本模型擬合程度明顯，其F值為73.74，P值小于0.000 1，說明模型極顯著；可用來進(jìn)行響應(yīng)值預(yù)測(cè)。根據(jù)模型失擬項(xiàng)P值為0.165 5＞0.05，不顯著，說明模型中不需要引入更高次數(shù)的項(xiàng)，模型選擇合適。所以，可以使用該模型來分析響應(yīng)值的變化。從表8還可以看出因素一次項(xiàng)（A、B、C、D）、二次項(xiàng)（A2、B2、C2、D2）對(duì)結(jié)果影響是極顯著的，交互項(xiàng)AC、AD、BC、BD對(duì)結(jié)果影響也極顯著。

2.4 響應(yīng)面互作效應(yīng)分析與優(yōu)化

從Box-Behnken試驗(yàn)方差分析的顯著性檢驗(yàn)可以看出，黃參漿添加量（A）和發(fā)酵劑添加量（D）的互作效應(yīng)對(duì)黃參胡蘿卜凝固型復(fù)合酸乳沉淀率影響明顯（P＜0.05），通過Design-Expert 8.0.5.0軟件作其響應(yīng)面曲線圖。圖1分別為4組以黃參胡蘿卜凝固型復(fù)合酸乳沉淀率為響應(yīng)值的趨勢(shì)圖，可以更直觀地反映出兩變量交互作用的顯著程度。

由圖1可以看出，響應(yīng)值存在最大值，通過軟件分析計(jì)算，得到黃參胡蘿卜凝固型復(fù)合酸乳預(yù)測(cè)值最大時(shí)的工藝參數(shù)為黃參漿添加量4.98%、胡蘿卜汁添加量9.72%、加糖量7.13%、發(fā)酵劑添加量4.05%，此條件下發(fā)酵3.5 h，預(yù)測(cè)值為44.83%?？紤]到實(shí)際配制的方便，將各因素條件修正為黃參漿添加量5%、胡蘿卜汁添加量10%、加糖量7%、發(fā)酵劑添加量4%，在此條件下發(fā)酵3.5 h。黃參胡蘿卜凝固型復(fù)合酸乳穩(wěn)定性最好，在修正條件下對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，黃參胡蘿卜凝固型復(fù)合酸乳沉淀率為45.29%。與理論預(yù)測(cè)值吻合得很好，表明模型合理有效。

2.5 酸乳品質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

表9 理化指標(biāo)Table9 Physical and chemical propertiess of yoghourt

表10 微生物指標(biāo)Table10 Microbiological indexes of yoghourt

3 結(jié) 論

3.1 通過Plackett-Burman設(shè)計(jì)、最陡爬坡試驗(yàn)對(duì)影響黃參胡蘿卜凝固型復(fù)合酸乳沉淀率及工藝條件進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)對(duì)黃參胡蘿卜凝固型復(fù)合酸乳沉淀率影響顯著的因素有黃參漿添加量、胡蘿卜汁添加量、發(fā)酵劑添加量和加糖量，而其他因素在試驗(yàn)設(shè)定的范圍內(nèi)影響不顯著。

3.2 通過對(duì)擬合二次回歸模型方差分析，發(fā)現(xiàn)黃參漿添加量和加糖量、黃參漿添加量和發(fā)酵劑添加量、胡蘿卜添加量和加糖量、胡蘿卜添加量和發(fā)酵劑添加量的互作效應(yīng)對(duì)黃參胡蘿卜凝固型復(fù)合酸乳沉淀率影響明顯。

3.3 通過Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析獲得的最佳工藝參數(shù)為黃參漿添加量4.98%、胡蘿卜汁添加量9.72%、加糖量7.13%、發(fā)酵劑添加量4.05%，在此條件下發(fā)酵3.5 h，黃參胡蘿卜凝固型復(fù)合酸乳沉淀率為 44.83%。實(shí)測(cè)值為45.29%，與理論預(yù)測(cè)值相比誤差小于1%。因此，利用響應(yīng)面分析方法對(duì)黃參胡蘿卜凝固型復(fù)合酸乳的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，可以獲得最優(yōu)的工藝參數(shù)，能有效地減少工藝操作的盲目性，從而為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

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