李長征 劉海東 崔 文 尋超群 孫賢學(xué) 姜銘章

(1濟(jì)寧市公安局刑偵支隊(duì),山東 濟(jì)寧 272000；2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)院，濟(jì)寧 272067)

案件現(xiàn)場(chǎng)接觸性檢材DNA的檢驗(yàn)一直是難題，傳統(tǒng)的DNA提取方法無論是chelex-100提取法、磁珠法還是硅珠法對(duì)目標(biāo)載體的選擇都為大載體，雖然可以保證獲取到足夠的DNA模板，但大體系的提取方法也降低了目標(biāo)DNA的單位濃度，從而造成擴(kuò)增結(jié)果的失敗。極微量的接觸性DNA檢材如果選取大載體進(jìn)行提取更容易獲得混合DNA分型。直接擴(kuò)增技術(shù)是使擴(kuò)增直接從檢材開始，對(duì)接觸性DNA檢材的檢驗(yàn)較傳統(tǒng)提取方法有著明顯優(yōu)勢(shì)[1]，其對(duì)目標(biāo)載體的選擇更有針對(duì)性，在保證獲得足夠模板DNA的同時(shí)，更容易得到單一個(gè)體來源的DNA分型。本文采用DNA直接擴(kuò)增技術(shù)對(duì)案件現(xiàn)場(chǎng)中的不同生物檢材DNA進(jìn)行直接擴(kuò)增，以探討該技術(shù)的有效性，為保證結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性，我們采取了在載體的一定面積內(nèi)選取多個(gè)點(diǎn)進(jìn)行平行擴(kuò)增的方法。

1 材料與方法

1.1 檢材

120份檢材全部來自本實(shí)驗(yàn)室日常受理案件中的現(xiàn)場(chǎng)生物檢材。包括手套20只，煙蒂20枚，上衣20件，飲料瓶、吸管20個(gè)，殘缺指紋40枚。分別剪取3處2mm×2mm手套拇指虎口或手背浮出的纖維、3處2mm×2mm煙蒂與口唇接觸處外面紙片、3處3mm×3mm上衣袖口或衣領(lǐng)處5cm×5cm面積內(nèi)布片、3處2mm×2mm擦拭飲料瓶口和吸管的擦拭棉簽、3處大小為2mm×2mm殘缺指紋擦拭濕棉簽。

1.2 儀器與試劑

ABI 9700 PCR儀和ABI 3500xL測(cè)序儀(美國ABI公司)；Identifiler Direct試劑盒(美國ABI公司)； Identifiler擴(kuò)增試劑盒(美國ABI公司)；5% chelex-100飽和溶液；10mg/ml，蛋白酶K(proteinose K,PK)；QIAGEN硅膜試劑盒。

1.3 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

將上述樣品采用Identifiler Direct PCR試劑盒進(jìn)行直接擴(kuò)增，操作按試劑盒說明進(jìn)行，擴(kuò)增體系12.5μl。將擴(kuò)增產(chǎn)物在ABI 3500xL遺傳分析儀上進(jìn)行電泳，電泳結(jié)果采用GeneMapper ID-X基因分析軟件分析。

另取上述相同樣品，分別采用QIAGEN硅膜和chelex-100提取法提取DNA，采用Identifiler試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，操作按推薦參數(shù)進(jìn)行，擴(kuò)增體系10μl。電泳及分析方法與上述相同。

2 結(jié)果

2.1 直接擴(kuò)增法與QIAGEN硅膜和chelex-100提取法比較

50份檢材分別采用直接擴(kuò)增、chelex-100法和QIAGEN硅膜法提取DNA后擴(kuò)增并進(jìn)行分型檢驗(yàn)，以15個(gè)STR基因座及Amelogenin全部檢出為檢驗(yàn)成功，檢出9個(gè)以上的STR基因座及Amelogenin為有效。

檢驗(yàn)結(jié)果顯示，同一檢材用3種方法檢測(cè)，分型結(jié)果并不相同，如在手套檢材的檢測(cè)中，直接擴(kuò)增法檢出的基因型均為單一個(gè)體來源，而QIAGEN硅膜及chelex-100法提取到2個(gè)獲取混合型。因此從圖1-3可以看出，相對(duì)于常規(guī)提取方法，直接擴(kuò)增發(fā)更易于獲得單一個(gè)體來源的DNA分型，其檢驗(yàn)結(jié)果具有更高的有效性。見圖1～3。

圖1 直接擴(kuò)增法檢測(cè)手套DNA分型圖譜

圖2 QIAGEN硅膜提取手套檢材DNA分型圖譜

圖3 chelex-100法提取手套檢材DNA分型圖譜

2.2 各種生物檢材成功率

直接擴(kuò)增法對(duì)手套檢材的成功率為90%，對(duì)煙蒂、衣服、飲料瓶和吸管、殘缺指紋的成功率分別為100%、70%、90%和60%，平均成功率達(dá)到70%以上。而相應(yīng)檢材QIAGEN硅膜成功率分別為50%、80%、60%、70%，30%；chelex-100成功率為50%、70%、40%、60%，10%。從表1中可以看出，直接擴(kuò)增技術(shù)對(duì)不同接觸性生物檢材DNA檢驗(yàn)成功率也高于常規(guī)提取方法。見表1。

表1 各種檢材的檢驗(yàn)成功率(n，%)

2.3 直接擴(kuò)增法平行檢驗(yàn)檢材接觸性DNA的可重復(fù)性

對(duì)5種檢材一定面積內(nèi)多處取點(diǎn)，采用直接擴(kuò)增法平行擴(kuò)增，結(jié)果表明，雖然不同類別的接觸性生物檢材在成功率上略有不同，但有效分型的結(jié)果相同，說明檢材不同位置取點(diǎn)均可保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性。每個(gè)檢材不同部位檢出有效率基本相同，其成功率可能與DNA在各個(gè)取點(diǎn)上存在的量有差異有關(guān)。除1例手套檢材的3個(gè)點(diǎn)位出現(xiàn)了2種不同分型外(可能與日常生活中混戴手套有關(guān))，其余檢材的多部位取點(diǎn)擴(kuò)增結(jié)果均為同一分型。見表2。

表2 直接擴(kuò)增法平行擴(kuò)增各種檢材結(jié)果(n，%)

3 討論

直接擴(kuò)增試劑盒自研發(fā)投入實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用以來，一直用于違法人員數(shù)據(jù)庫的建設(shè)。檢材均為單一個(gè)體來源，F(xiàn)TA卡或?yàn)V紙?zhí)崛?，檢驗(yàn)中省略了提取過程，大大節(jié)省了建庫的成本，提高了檢驗(yàn)效率。一直以來，由于受到常規(guī)DNA檢驗(yàn)觀念的影響，認(rèn)為這種免提取的直接擴(kuò)增試劑盒只能應(yīng)用于FTA卡提取的血液檢材，而未將其作用進(jìn)一步的開發(fā)。本實(shí)驗(yàn)室在日常檢案中，最先將直接擴(kuò)增試劑盒和直接擴(kuò)增方法應(yīng)用到除血卡、血濾紙以外的其他單一個(gè)體來源的DNA檢材，如口腔拭子、毛發(fā)、肋軟骨、肌肉組織等，發(fā)現(xiàn)效果十分理想。這一應(yīng)用在很大程度上解決了提取過程中繁瑣的操作步驟，大大減輕了工作的強(qiáng)度。

本文中將直接擴(kuò)增試劑盒應(yīng)用到案件現(xiàn)場(chǎng)接觸性檢材的DNA分析，發(fā)現(xiàn)直接擴(kuò)增法檢驗(yàn)接觸性DNA成功率明顯高于QIAGEN硅膜和chelex-100法。其主要原因是由于直接擴(kuò)增法對(duì)剪取的適量接觸性檢材不需要再加入其它試劑即可直接擴(kuò)增，單位體系DNA濃度較高；而采用常規(guī)QIAGEN硅膜、chelex-100法提取DNA，在提取環(huán)節(jié)中加入的各種提取試劑使本來就微量的檢材DNA被進(jìn)一步被稀釋，降低了DNA模板濃度。對(duì)于常量DNA檢材不影響檢驗(yàn)結(jié)果，而對(duì)于接觸性微量檢材，稀釋環(huán)節(jié)就有可能使DNA模板濃度達(dá)不到檢出的閾值，從而降低了檢出率[2]。

本文結(jié)果顯示，直接擴(kuò)增法相對(duì)于QIAGEN硅膜和chelex-100法提取法更易于獲得單一個(gè)體來源的DNA分型，使檢驗(yàn)結(jié)果具有更高的有效性。分析原因?yàn)橹苯訑U(kuò)增法剪取檢材面積較小，有利于獲得單一個(gè)體的脫落細(xì)胞； QIAGEN硅膜和chelex-100提取法，由于需要檢材量較大，大面積的取材則較容易提取到多人遺留的脫落細(xì)胞。

本文將案件現(xiàn)場(chǎng)接觸性檢材采用一定面積內(nèi)多處取點(diǎn)進(jìn)行平行擴(kuò)增，可以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性。對(duì)檢材進(jìn)行小面積的取點(diǎn)，更容易獲得單一的DNA分型，同時(shí)也容易“取不到”目標(biāo)DNA，或者恰好取到“無關(guān)DNA”，造成結(jié)果的失敗或偏差。多處取點(diǎn)，平行擴(kuò)增可以有效地保證結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性，從而取得較高的成功率。

綜上所述，將直接擴(kuò)增技術(shù)應(yīng)用到現(xiàn)場(chǎng)案件不同接觸性生物檢材，創(chuàng)新了一套針對(duì)接觸性DNA檢材的直擴(kuò)方法，多點(diǎn)取材、平行擴(kuò)增、分類提取等直接擴(kuò)增技術(shù)，為疑難生物檢材的檢驗(yàn)應(yīng)用提供了可靠的解決方案。

[1] 張艷霞，李愛強(qiáng)，趙麗.直接擴(kuò)增法用于現(xiàn)場(chǎng)檢材DNA檢驗(yàn)[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2012，27(1)：62-63.

[2] 李林，劉靜，王敏.直接擴(kuò)增法在血痕、肋軟骨和唾液檢材中的應(yīng)用[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志，2013，28(2)：148-149.