孫平江 錢荷英 李木旺 張月華 宋紅生 徐安英

(1江蘇科技大學蠶業(yè)研究所， 江蘇鎮(zhèn)江 212018； 2上海大學生命科學院， 上海 200444)

家蠶以卵滯育，是長期適應不良環(huán)境而形成的固有性狀。蠶卵滯育的發(fā)生與化性有關，主要由遺傳因素決定，同時也受溫度、光線、濕度和營養(yǎng)等外界條件的影響。家蠶按1年發(fā)生世代數(shù)的多少，大致可以分為所有的世代都滯育的系統(tǒng)(一化性)、對所處環(huán)境應答而決定滯育性的系統(tǒng)(二化性)，以及完全不滯育的系統(tǒng)(多化性)。這些遺傳性狀是作為地理的變異被固定下來的[1]。其中多化性蠶品種又分為有滯育期多化性和無滯育期多化性2類。已有的研究表明[2-3]，家蠶卵的滯育與否是滯育激素(Diapause Hormone，DH)誘導的，無滯育期多化性品種也存在滯育激素基因，可能是因其不表達或者翻譯后滯育激素被降解，從而呈現(xiàn)全年無滯育性的現(xiàn)象。有滯育期多化性蠶品種，常規(guī)采用1年春、夏、早秋、晚秋飼養(yǎng)4代進行保育[4]，這樣就可以得到足夠的適合繼代保存的滯育卵；而無滯育期多化性蠶品種則需要全年不間斷地飼養(yǎng)，一般每年需要飼養(yǎng)7～8代。

中國農(nóng)業(yè)科學院國家蠶種質(zhì)資源保存中心承擔著10余份無滯育期多化性蠶種質(zhì)資源的保存任務，而本地區(qū)在11月下旬就進入初霜期，晚霜終止期在翌年的3月中下旬，全年無霜期僅230 d左右。因此，每年只能用桑葉養(yǎng)蠶4～5次，再借助人工飼料繼代2～3次，才能完成無滯育期多化性蠶品種的保育任務。由于部分多化性蠶品種對人工飼料的攝食性差，這給無滯育期多化性蠶品種的保存帶來很大的風險，且勞動強度大，保存成本高。為了減少每年對多化性家蠶品種的保育代數(shù)，有必要在不影響蠶品種的化性、主要形態(tài)特征和經(jīng)濟性狀的條件下，對無滯育期多化性蠶品種在本地冬季的保存方法進行探討，以求更有效、更安全地保存這些蠶品種資源。

滯育激素對昆蟲滯育的影響及作用機理等理論的研究已經(jīng)比較透徹了[5-7]，而利用滯育激素在家蠶種質(zhì)資源保存方面的實際應用卻未見報道。本研究欲通過對無滯育期多化性蠶品種的蠶蛹，進行微量注射滯育激素的方法，使其蠶蛾能產(chǎn)下滯育卵，以減少飼育世代，降低品種保存的風險和成本。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蠶品種： SR5 (代號7025)，無滯育期多化性品種，從泰國引進，中國農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所保存。主要試劑：滯育激素，上海大學生命科學院合成提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗時期 選擇在無滯育期多化性蠶品種SR5進行桑葉飼養(yǎng)的最后1個蠶期(晚秋蠶或晚晚秋蠶)進行蛹體注射DH試驗，保證多化性蠶品種1年發(fā)生4～5代，維持其多化性蠶品種的特性。試驗于 2007年10月收蟻飼養(yǎng)，2007年11月上蔟結(jié)繭，化蛹24 h后開始蠶蛹注射DH試驗；子一代蠶卵的滯育情況與蠶的性狀調(diào)查于2008年1月進行；子二代蠶卵的滯育情況調(diào)查于2008年3月進行。

1.2.2 化蛹經(jīng)過時間的確定 在25.5 ℃的蔟中環(huán)境條件下，在蠶上蔟2 d后采繭，削開尚未化蛹的蠶繭，置于恒溫箱中(溫度25 ℃、相對濕度65%～75%)保存，觀察并記載每頭蠶的實際化蛹時間(h)。按化蛹時間的先后順序?qū)⒋朴?、雄蛹分類，進行正常蛹期的保護處理；雌蛹供注射DH用，雄蛹單獨另放，不需記載化蛹時間，留待化蛾交配。

1.2.3 DH的配制與注射方法 注射前用無菌水稀釋DH, 配制成0.5 μg/μL的DH注射液。設每個蠶蛹DH的注射劑量分別為1.0 μg (注射2 μL)、2.0 μg (注射4 μL) 2個處理，每個處理注射10個雌蛹，3個重復。將不同化蛹時間的雌蠶蛹，用75%的酒精擦拭蛹體，然后用10 μL的微量注射器進行注射，將注射器針頭對準蠶蛹的中下部腹節(jié)的節(jié)間膜處刺入，沿蛹表皮內(nèi)側(cè)平行向上腹部推進，注射深度約0.5～1.0 cm左右，定量注射后緩慢拔出針頭，再用75%的酒精擦拭注射傷口。

1.2.4 注射DH后蠶蛹及蠶卵的保護 將已注射DH的蠶蛹分攤于干凈的透氣容器盒內(nèi)，在25～26 ℃的溫度和70%～75%的相對濕度條件下保護至羽化，并與正常雄蛾進行交配、產(chǎn)卵，在產(chǎn)卵后的第3天將產(chǎn)下的蠶卵隨機分成2份，1份按照常規(guī)溫濕度標準催青至孵化，調(diào)查各蛾圈的滯育卵數(shù)及非滯育卵數(shù)；另1份蠶種隨機選取10蛾圈進行低溫冷藏用于后代性狀調(diào)查試驗。

1.2.5 注射DH對后代性狀的影響 將1.2.4中保留的10蛾圈蠶卵，在2.5 ℃的條件下冷藏約40 d，取出后按照冷藏浸酸的標準進行浸酸處理后，進行催青、收蟻、飼養(yǎng)，調(diào)查注射DH后對滯育卵當代相關性狀的影響；產(chǎn)卵后第4天調(diào)查卵色與產(chǎn)卵粒數(shù)，孵化后調(diào)查普通孵化率，孵化后第2天調(diào)查卵殼色、產(chǎn)卵粒數(shù)與普通孵化率(取10蛾蠶卵的平均數(shù))；收蟻前調(diào)查蟻蠶體色，5齡第5天調(diào)查壯蠶體色與斑紋；采繭后第4天調(diào)查繭色、繭形、全繭量、繭層量、繭層率；用常規(guī)方法蛹期保護，發(fā)蛾后自交產(chǎn)卵，常規(guī)方法催青孵化，調(diào)查蠶卵的滯育與否。按以上方法再飼養(yǎng)1期蠶，調(diào)查子二代蠶卵的滯育情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 合適注射DH的化蛹經(jīng)過時間的確定

對不同化蛹時間的蠶蛹，分別注射不同劑量的DH，各試驗區(qū)每卵圈產(chǎn)生的滯育卵數(shù)量及滯育卵率均有差別。由表1可見,蠶蛹注射DH的有效時間,是化蛹后24～120 h；在這段化蛹時間內(nèi)，只要對蠶蛹注射適當劑量的DH，均能達到很高的滯育卵率。蠶蛹注射DH的最佳化蛹經(jīng)過時間為24～86 h，例如在化蛹經(jīng)過24 h注射2.0 μg的DH稀釋液時，滯育卵率達到95.77%；化蛹經(jīng)過86 h注射2.0 μg的DH稀釋液時，滯育卵率同樣能達到96.95%，有部分卵圈的滯育卵率達到100%。在這個化蛹階段(24～86 h)，滯育卵率最低的也有86.90%(注射2.0 μg時)，基本能滿足生產(chǎn)和科研的需要。當化蛹時間為120 h時，雖然也產(chǎn)生少量的滯育卵，但其滯育率太低，不能保證生產(chǎn)的需求；當化蛹時間超過149 h后，無論注射多少DH都不能產(chǎn)生滯育卵，即難以再用人為因素(注射DH)進行干涉。

表1化蛹后不同經(jīng)過時間的SR5蠶蛹用不同劑量DH注射后的蠶卵滯育情況

化蛹后經(jīng)過時間(h)不受精卵數(shù)(粒)非滯育卵數(shù)(粒)滯育卵數(shù)(粒)良卵數(shù)(粒)滯育卵率(%)1 0μg2 0μg1 0μg2 0μg1 0μg2 0μg1 0μg2 0μg1 0μg2 0μg2424321481623636238437861 4695 77451518921824731633933472 8694 615512141261227933140534368 8996 506410221301623632236633864 4895 27721122814431229239333679 3986 90865648112926228637429570 0596 95107150131203246241022725610 573 91120125146250260492542691 573 3514948512983210029832100

調(diào)查項目的數(shù)據(jù)為3次重復試驗的平均數(shù)；非滯育卵中包含再出卵及轉(zhuǎn)青死卵；滯育卵率以滯育卵數(shù)占良卵數(shù)的百分比計算。

2.2 合適注射DH劑量的確定

在合適的化蛹時間(24～120 h)內(nèi)注射適量的DH均能產(chǎn)生數(shù)量不等的滯育卵，而產(chǎn)生滯育卵數(shù)量的多少，又與其注射的劑量有直接的關系。當化蛹時間在24～86 h時，采用不同的DH劑量注射蠶蛹，結(jié)果是DH注射的劑量越大，得到的滯育卵率就越高，滯育卵率以注射2.0 μg DH的處理區(qū)高，如在這一時間段的1.0 μg劑量注射區(qū)，平均所產(chǎn)卵的滯育卵率為69.52%，當注射劑量提高到2.0 μg時，除了72 h的滯育卵率為86.90%，其余幾個時間段的滯育卵率均超過了94.61%。但是，當化蛹時間超過107 h時，則正好相反，DH注射的劑量越大，得到的滯育卵率就越低，如化蛹時間為107 h時， 1.0 μg、2.0 μg注射區(qū)的滯育卵率分別為10.57%和3.91%(表1)，其原因有待于進一步探討。

2.3 蠶蛹注射DH后對蠶卵受精情況的影響

從化蛹后不同經(jīng)過時間的蠶蛹注射不同劑量的DH后蠶卵的滯育情況看，對蠶蛹注射DH對蠶卵的受精情況產(chǎn)生一定的影響，特別是對化蛹后經(jīng)過時間長的蛹(107～120 h)影響較大，不受精卵數(shù)明顯增加(表1)，約占總卵數(shù)的32%以上，其余時間的不受精卵率最高的為14%左右，最低的僅為3%左右。

2.4 注射DH對后代性狀的影響

通過注射DH得到的滯育卵，在2.5 ℃的條件下冷藏約40 d浸酸處理后飼養(yǎng)，調(diào)查其各項性狀，除了孵化率稍低與孵化不夠整齊以外，其它性狀，如幼蟲斑紋、體色、齡期經(jīng)過、繭形、繭色等與對照區(qū)并無差異。蠶蛹化蛾后再進行自交產(chǎn)卵，蠶卵直接進行常規(guī)催青，結(jié)果顯示：所有的卵圈中，沒有滯育卵，說明DH注射后除孵化率和孵化整齊度有所下降外，對無滯育期多化性蠶品種后代的絕大部分性狀不會產(chǎn)生影響，其化性又恢復其多化性的特性。再對子一代非滯育卵進行跟蹤調(diào)查，其化性依然保持多化性狀；還對子二代的蠶卵滯育情況進行了調(diào)查，均為非滯育蠶卵。由此可見，通過對家蠶無滯育期多化性蠶品種的雌蠶蛹進行DH注射，能夠使無滯育期多化性家蠶蛾產(chǎn)下滯育卵(圖1-2)，且其滯育性不具有遺傳性，其后代解除滯育后仍恢復無滯育期多化性蠶品種的特性(表2)。

圖1 蠶蛹注射DH后產(chǎn)下滯育卵(蠶卵著色)

圖2 蠶蛹未注射DH產(chǎn)下非滯育卵(蠶卵不著色)

表2無滯育期多化性蠶品種SR5蠶蛹注射DH后子一代的主要性狀

處理區(qū)卵色卵殼色蟻蠶體色產(chǎn)卵粒數(shù)(粒/蛾)普通孵化率(%)5齡經(jīng)過(d∶h)全齡經(jīng)過(d∶h)蠶蛹注射DH淡黃色乳白色黑褐色37694 418∶0025∶12蠶蛹未注射DH淡黃色乳白色黑褐色38592 477∶1225∶00處理區(qū)壯蠶體色壯蠶斑紋繭色繭形全繭量(g)繭層量(g)繭層率(%)蠶蛹注射DH青白色素蠶金黃色長橢圓1 020 14013 73蠶蛹未注射DH青白色素蠶金黃色長橢圓1 060 14313 52

3 討論

家蠶卵的滯育性主要由遺傳因素決定，但通過人工的方法可以有效地使其改變，如用冷藏、浸酸等方法可以解除一化、二化卵的滯育性，實現(xiàn)一年多次養(yǎng)蠶，滿足科研、生產(chǎn)的需求。本研究則探討了用DH處理適當化蛹時間的無滯育期多化性蠶蛹，使其產(chǎn)生滯育卵，從而減少養(yǎng)蠶次數(shù)、降低品種保存風險和成本的方法。實驗結(jié)果表明：在化蛹后24 h至120 h之間，用1 μg、2 μg的 DH處理都能產(chǎn)生有效的滯育卵，而蠶蛹注射DH的最佳時間是化蛹后的24～86 h，每個蠶蛹注射DH的最佳劑量是2 μg。至于試驗時不選用24 h前的蠶蛹進行注射試驗，主要是因為此時的蠶蛹很嫩，極易碰破皮膚或造成注射后傷口感染而導致死蛹，雖然該時段注射DH后也有可能產(chǎn)生較多滯育卵，但也不建議在此階段進行DH注射。化蛹149 h之后，無論用多大劑量的DH處理蠶蛹，均不能產(chǎn)生滯育卵。可能是由于此時蛹期經(jīng)過時間已過半，卵母細胞已進入晚期生長階段，其滯育與否也已決定，外界因素無法再改變。

經(jīng)滯育激素處理的無滯育期多化性品種所產(chǎn)的卵，其滯育性不具遺傳性，后代均能恢復無滯育期多化性的特征，因為沒有改變其遺傳物質(zhì)(DNA)，所以不必擔心其化性或形態(tài)特征、經(jīng)濟性狀的改變，是安全有效的減少養(yǎng)蠶次數(shù)、降低品種保存成本的方法。我們選擇在最后一期蠶(晚秋)進行，主要是讓無滯育期多化性品種充分保持其固有的多化性特征，適當減少2～3個飼養(yǎng)世代數(shù)。至于經(jīng)處理的滯育卵在2.5 ℃的條件下冷藏40 d，按冷藏浸酸的標準處理解除滯育后，蟻蠶的孵化率低及孵化不夠整齊的原因，認為可能是蠶卵的冷藏天數(shù)不足，滯育尚未完全解除所致。

[1] 黃君霆.家蠶滯育分子機制的研究[J].蠶業(yè)科學，2003，29(1)：1-6.

[2] 磯部稔，黃君霆.滯育激素的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)[J].國外農(nóng)學—蠶業(yè)，1980，1(3)：11.

[3] 徐衛(wèi)華，佐藤行洋，山下興亞.家蠶滯育激素基因的克隆[J].遺傳學報，1995，22 (3)：178-184.

[4] 姚琴，陳克平，林昌麒,等.家蠶有滯育期多化性品種隔期保育法研究[J].蠶業(yè)科學，1993，19(2)：111-113.

[5] 徐衛(wèi)華.家蠶滯育的分子機理 2——蛹期滯育激素基因的表達與滯育決定[J].遺傳學報，1999，26(2)：107-111.

[6] 陳田飛，樂波靈.家蠶滯育機理研究概況[J].廣西蠶業(yè),2004,41(3)：12-16.

[7] 王方海，龔和.滯育激素的研究進展[J].昆蟲天敵，1997，19(2)：88-92.