劉練，張高福，李秋，王墨

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院腎臟免疫科、兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預(yù)防國(guó)際科技合作基地，重慶400014)

阿霉素誘導(dǎo)的腎病模型，被認(rèn)為能夠較好的模擬人類(lèi)微小病變和局灶性節(jié)段性腎小球硬化的腎臟病理改變［1］，長(zhǎng)期以來(lái)，大部分實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象以大鼠為主，但對(duì)阿霉素腎病小鼠模型的報(bào)道卻較少，并且實(shí)驗(yàn)周期較短［2，3］。本課題組在成功復(fù)制幼年大鼠阿霉素腎病模型的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，擬建立較長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)周期的阿霉素腎病小鼠模型，以期通過(guò)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)模型轉(zhuǎn)變過(guò)程的研究獲得穩(wěn)定性好、可重復(fù)、與人體疾病契合度高的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，為進(jìn)一步的科學(xué)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性BALB/c 小鼠48 只，6 周齡，體重(21.79 ±1.41 )g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK(渝)2012-0001】，所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)兒科研究所動(dòng)物中心SPF 環(huán)境中【SYXK(渝)2012-0015】，自由飲水進(jìn)食。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及模型建立

將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組與模型組，對(duì)照組24只，模型組24 只。固定好小鼠，用75%酒精消毒鼠尾皮膚，模型組經(jīng)尾靜脈一次注射阿霉素(Pharmacia 公司，意大利)10.5 mg/kg，對(duì)照組注射等量的生理鹽水。

1.3 標(biāo)本的收集和檢測(cè)

1.3.1 24 h 尿液的收集和檢測(cè)

分別將小鼠置于代謝籠中，禁食不禁水，于實(shí)驗(yàn)的第0、2、4、6、8 和12 周收集小鼠24 h 全部尿液，5000 r/min×5min，離心，收集上清、分裝，－20℃保存。

1.3.2 血標(biāo)本的收集和檢測(cè)

分別于實(shí)驗(yàn)周期的第4、8、12 周末，處死小鼠。10%水合氯醛(3mL/kg)腹腔注射麻醉小鼠后，經(jīng)眼球靜脈采血，全血在室溫下自然凝固，待血清析出后，4000 r/min × 10 min，離心，分離血清，并于－20℃保存。全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清白蛋白、總膽固醇、低密度脂蛋白、肌酐。

1.3.3 腎組織的收集和檢測(cè)

獲得血標(biāo)本后，用生理鹽水對(duì)雙側(cè)腎臟進(jìn)行原位灌洗，直至雙腎發(fā)白，剝離腎臟包膜，稱重。將雙腎分別均分為3 等份，取左腎上下段1/3，放置于4%多聚甲醛中24 h，經(jīng)脫水、石蠟包埋后制成腎臟病理標(biāo)本，用于HE、PAS 染色;取右腎上段約1 mm3的腎皮質(zhì)組織，用4℃2.5%戊二醛固定1 h，送重慶醫(yī)科大學(xué)電鏡室。

1.3.4 腎小球硬化指數(shù)(glomerulosclerosis index，GSI)的統(tǒng)計(jì)

腎組織石蠟切片，經(jīng)HE、PAS 染色，光鏡下根據(jù)腎小球毛細(xì)血管袢塌陷或消失、腎小囊斷裂或纖維素樣物滲出，半定量評(píng)價(jià)腎小球硬化程度，GSI 的統(tǒng)計(jì)方法［4］為:腎小球硬化程度根據(jù)腎小球硬化灶所占腎小球比例分為5 個(gè)等級(jí)，0 級(jí):腎小球基本正常;1 級(jí):腎小球硬化面積≤25%;2 級(jí):25%＜腎小球硬化面積≤50%;3 級(jí):50%＜腎小球硬化面積≤75%;4 級(jí):腎小球硬化面積＞75%。根據(jù)每張切片腎小球平均硬化面積積分計(jì)算出GSI 表示腎小球硬化程度，公式為GSI=［(1 ×N1 +2 ×N2 +3 ×N3 +4×N4)/每張切片腎小球總數(shù)］×100%(N1 表示1級(jí)損害腎小球個(gè)數(shù)，… N4 表示4 級(jí)損害腎小球個(gè)數(shù))。每一張切片選取10 個(gè)不重疊高倍視野并拍攝照片，統(tǒng)計(jì)分析10 張照片中腎小球硬化的情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)用(±s)表示，采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 24 h 尿蛋白檢測(cè)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)2 周，模型組24 h 尿蛋白含量較正常組明顯增高，持續(xù)至第12 周，第8 周時(shí)出現(xiàn)高峰(見(jiàn)表1)。

2.2 血清生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

與正常組相比，模型組于實(shí)驗(yàn)第4 周出現(xiàn)低蛋白血癥，第8 周出現(xiàn)高脂血癥，至12 周時(shí)，血清中肌酐明顯高于正常組(見(jiàn)表2)。

表1 不同時(shí)期24 h 尿蛋白水平(n=8，±s，mg/24 h)Tab.1 Twenty-four-hour proteinuria levels in different periods

注:與對(duì)照組比較，* P＜0.05;與模型組第8 周比較，▲P＜0.05。Note:* P＜0.05，VS.Control group;▲P＜0.05，VS.The 8th week of model group.

時(shí)間(wk.)0 wk.2 wk.4 wk.6 wk.8 wk.12 wk.對(duì)照組Control0.50 ±0.120.46 ±0.220.45 ±0.290.67 ±0.380.48 ±0.240.37 ±0.25模型組Model0.49 ±0.21▲1.39 ±0.89＊▲1.52 ±0.61＊▲1.70 ±0.67*1.96 ±0.68*1.59 ±0.97＊▲

表2 不同時(shí)期血清生化指標(biāo)檢測(cè)(n=8，±s)Tab.2 Serum biochemical indexes in different periods

表2 不同時(shí)期血清生化指標(biāo)檢測(cè)(n=8，±s)Tab.2 Serum biochemical indexes in different periods

注:與對(duì)照組比較，* P＜0.05。Note:* P＜0.05，vs.control group.

組別Group時(shí)間Week白蛋白/g/L Albumin總膽固醇/mmol/L Total cholesterol低密度脂蛋白/mmol/L Low-density lipoprotein肌酐/μmol/L Creatinine 4wk32.87 ±1.502.92 ±0.380.35 ±0.104.33 ±3.06對(duì)照組Control8wk30.23 ±0.803.22 ±0.350.34 ±0.054.67 ±0.58 12wk29.38 ±0.722.93 ±0.400.34 ±0.015.50 ±1.29 4wk28.01 ±2.92*3.01 ±0.430.35 ±0.096.25 ±3.01模型組Model8wk26.70 ±0.81*4.59 ±1.14*0.44 ±0.05*5.60 ±0.89 12wk24.81 ±0.87*5.17 ±0.83*0.49 ±0.11*7.71 ±4.61*

2.3 不同時(shí)間點(diǎn)腎臟病理改變

2.3.1 腎臟HE 染色及PSA 染色檢測(cè)結(jié)果

對(duì)照組小鼠在三個(gè)觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)HE 染色及PAS染色形態(tài)均正常(見(jiàn)圖1.a-c，圖2.a-c)。模型組小鼠第4 周時(shí)，HE 染色及PAS 染色可見(jiàn)腎小球血管袢與囊壁有輕度粘連，腎小球及腎小管形態(tài)基本正常;第8 周時(shí)HE 染色可見(jiàn)腎小球系膜細(xì)胞增生，系膜區(qū)擴(kuò)大，腎小管管腔出現(xiàn)大量蛋白管型，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);第12 周時(shí)HE 染色可見(jiàn)部分腎小球萎縮，部分血管的血管腔縮小或閉塞，血管袢塌陷，系膜細(xì)胞增生，系膜區(qū)擴(kuò)大，腎小管上皮細(xì)胞可見(jiàn)空泡樣改變，部分管腔內(nèi)有蛋白管型，伴腎間質(zhì)炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn);PAS 染色顯示部分腎小球有節(jié)段性玻璃樣硬化(見(jiàn)圖1.d-f，圖2.d-f)(圖1、2 見(jiàn)彩插1)。

2.3.2 腎臟透射電鏡檢測(cè)結(jié)果

對(duì)照組小鼠在三個(gè)觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)透射結(jié)果均無(wú)異常。模型組小鼠第4 周出現(xiàn)足突部分融合，內(nèi)皮細(xì)胞及基底膜無(wú)改變;第8 周足突融合較前廣泛;第12 周時(shí)足突廣泛融合，腎小球基底膜局部明顯增厚，系膜細(xì)胞增殖(見(jiàn)圖3)。

2.4 腎小球硬化指數(shù)(GSI )

模型組第12 周GSI 為(2.81 ±0.84)%，明顯高于同一觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組GSI(0.33 ±0.21)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

3 討論

圖3 各期腎臟電鏡下改變Note:a.Control group;b.Model group(4 weeks);c.Model group(8 weeks);d.Model group(12 weeks)Fig.3 Morphological change in the renal tissues under transmission electron microscopy

阿霉素(adriamycin，ADR)是臨床上常用的一種蒽環(huán)類(lèi)廣譜抗腫瘤藥物，其建立鼠類(lèi)腎病模型的主要作用機(jī)制包括三個(gè)方面:①通過(guò)細(xì)胞毒作用，直接損傷腎細(xì)胞，在DNA 水平干預(yù)足細(xì)胞蛋白的合成，造成足細(xì)胞的形態(tài)改變［5］;②在腎臟內(nèi)的代謝產(chǎn)物與氧反應(yīng)產(chǎn)生活性氧，誘發(fā)腎小球上皮細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致濾過(guò)膜的結(jié)構(gòu)和功能破壞［6］;③嵌入DNA 而抑制RNA 的合成，造成腎臟近曲小管上皮細(xì)胞含有DNA、RNA 的細(xì)胞器損傷［7］。

根據(jù)國(guó)外阿霉素腎病大鼠模型的實(shí)驗(yàn)報(bào)道［1、8］，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)O(shè)計(jì)給予BALB/c 小鼠9.0、10、10.5、11、11.5、12 mg/kg 共6 個(gè)阿霉素注射劑量，每個(gè)劑量組6 只小鼠，實(shí)驗(yàn)周期12 周，重點(diǎn)觀察小鼠的死亡情況和腎臟病理改變，以期獲得最適合的建立BALB/c 小鼠腎病模型的劑量。我們發(fā)現(xiàn)11 mg/kg 組、11.5 mg/kg 組、12 mg/kg 組實(shí)驗(yàn)至第12 周均出現(xiàn)部分死亡，死亡率分別為16.7%、33.3% 和66.7%。而9.0 mg/kg 組、10 mg/kg 組、10.5 g/kg組實(shí)驗(yàn)至第12 周均未出現(xiàn)死亡，但電鏡掃描顯示9.0 mg/kg 組和10 mg/kg 組實(shí)驗(yàn)至第8 周，腎臟足細(xì)胞足突僅有輕微融合;而10.5 mg/kg 組實(shí)驗(yàn)至第4 周時(shí)發(fā)現(xiàn)小鼠腎臟在光鏡下無(wú)明顯病理改變，電鏡可見(jiàn)足突部分融合，符合人類(lèi)微小病變型腎病的病理改變，第8 周時(shí)光鏡下可見(jiàn)系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生，電鏡顯示足突廣泛融合，但腎小球硬化不明顯;第12 周時(shí)光鏡可見(jiàn)腎小球局灶節(jié)段性硬化，伴腎小管空泡樣變、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、腎間質(zhì)損害，電鏡發(fā)現(xiàn)足突廣泛融合、腎小球基底膜局部增厚、系膜細(xì)胞增殖，這些改變均符合人類(lèi)局灶性節(jié)段性腎小球硬化的病理特點(diǎn)。故本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)給予BALB/c 小鼠注射10.5 mg/kg 的阿霉素能較好模擬人類(lèi)微小病變型腎病綜合征和局灶性節(jié)段性腎小球硬化的病理改變。

兒童腎病綜合征以微小病變型最常見(jiàn)［9］，大部分對(duì)激素敏感，部分對(duì)激素治療依賴或者抵抗的患兒，5～10 年可轉(zhuǎn)變?yōu)榫衷钚怨?jié)段性腎小球硬化［10］，轉(zhuǎn)變周期較成人長(zhǎng)。在既往的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)腎病大鼠發(fā)生硬化時(shí)間較早，6～8 周即出現(xiàn)了腎小球硬化［11］，而本實(shí)驗(yàn)中模型組小鼠在實(shí)驗(yàn)12 周時(shí)才發(fā)生局灶性節(jié)段性腎小球硬化，說(shuō)明腎病小鼠發(fā)生硬化的時(shí)間比大鼠長(zhǎng)，這提示小鼠腎病模型可能比大鼠更適合用于模擬兒童腎病綜合征的發(fā)展過(guò)程。

作為一種常用的模擬人類(lèi)微小病變腎病的經(jīng)典動(dòng)物模型，阿霉素腎病既往的動(dòng)物選擇主要是對(duì)阿霉素高度敏感的Wistar 大鼠、SD 大鼠，其模型特征迅速、持久、穩(wěn)定［12］。但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，一些原發(fā)性腎病綜合征的發(fā)病與足細(xì)胞相關(guān)蛋白編碼的NPHS1、NPHS2、WT1 等基因突變有密切關(guān)系［13］，所以基因檢測(cè)將成為研究腎病發(fā)病機(jī)制、判斷預(yù)后的主要手段。由于小鼠有99%的基因跟人類(lèi)相同，所有的器官和系統(tǒng)均跟人類(lèi)相似，所以不論是從遺傳學(xué)，還是病理生理學(xué)來(lái)看，小鼠和人類(lèi)都具有高度同源性，并且小鼠模型在基因敲出、基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)開(kāi)展方面已經(jīng)比較成熟［14］。綜上所述，無(wú)論是從作用時(shí)間、實(shí)驗(yàn)技術(shù)，建立阿霉素小鼠腎病模型，對(duì)進(jìn)一步開(kāi)展腎病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究都有十分重要的意義［15］。

(本文圖1、2 見(jiàn)彩插1 及封面)。

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