李淼，郁麗麗，張藝寶，強蘇靜，劉麗均，徐平，

(1.中國科學院上海生命科學研究院，上海 201615;2.上海斯萊克實驗動物有限責任公司，上海 201615;3.南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學系，南京 210095)

1949 年英國的Polge 和Smith 等［1］在偶然情況下，發(fā)現(xiàn)低溫保存精子時加入甘油，可以增加精子的活力，揭開了低溫生物學發(fā)展的里程碑。小鼠作為研究哺乳動物胚胎發(fā)育以及人類遺傳疾病的典型模式動物，在生命科學領(lǐng)域發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。低溫冷凍保存生殖細胞、生殖組織以及胚胎，這種更安全可靠的方法是保存具有研究價值品系小鼠的關(guān)鍵［1，2］。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

C57BL/6J、ICR 小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司【SCXK(滬)2012－0002】，在獨立換氣籠盒系統(tǒng)(IVC)飼養(yǎng)，動物自由采食60Co 滅菌飼料(30KGy)和高壓滅菌水，其他飼養(yǎng)環(huán)境和條件嚴格參照IVC 使用手冊以及無特定病源動物(SPF 級動物)飼養(yǎng)標準操作規(guī)程(SOP)執(zhí)行。

1.1.2 主要儀器與試劑

體視顯微鏡(Nikon SMZ645);解剖顯微鏡(Nikon CP－S);熒光顯微鏡(Leica DMI3000 B);CO2培養(yǎng)箱(Hera，Cell，Kandro)。二甲基亞砜;丙二醇;L－15 培養(yǎng)液;1 × HBSS;胎牛血清(FBS);LIVE/DEAD Sperm Viability Kit(L－7011)。

1.2 方法

1.2.1 附睪組織采集

性成熟并交配過6～8 周齡C57BL/6J 雄鼠，處死后從腹腔內(nèi)取出附睪。在0℃L－15 培養(yǎng)液中清洗去除多余脂肪、血漬及其他組織，4℃1 × HBSS液中保存。

1.2.2 冷凍和復(fù)蘇

將采集的組織隨機放入含有1.0 mL 冷凍保護劑的1.8 mL 冷凍管中(2 個/管)。二甲基亞砜組0℃30 min 196℃液氮中保存;丙二醇組4℃30 min－196℃液氮中保存。R18S3組液氮表面10 min 液氮保存。每組隨機選取10 個附睪冷凍，其中3 個附睪用于熒光染色以及精子形態(tài)檢測，另外6 個用于胞質(zhì)內(nèi)單精子注射。

二甲基亞砜冷凍保護劑成分:L－15 培養(yǎng)液、1.5 mol/L 二甲基亞砜、0.0 5mol/L 蔗糖、10%(v/v)胎牛血清。丙二醇冷凍保護劑成分:L－15 培養(yǎng)液、1.5 mol/L 丙二醇、0.05 mol/L 蔗糖、10%(v/v)胎牛血清。另一種冷凍保護劑為R18S3［16］。

將采集的組織隨機放入含有1.0 mL 冷凍保護劑的1.8 mL 冷凍管中(2 個/管)。二甲基亞砜組0℃30 min ﹣196℃液氮中保存;丙二醇組4℃30 min ﹣196℃液氮中保存。R18S3組液氮表面10 min液氮保存。

復(fù)蘇:37℃水浴復(fù)蘇。二甲基亞砜及丙二醇組去除冷凍保護劑分4 步完成，每步5 min.。①1.0 mol/L 二甲基亞砜(丙二醇)、0.05 mol/L 蔗糖、10%胎牛血清、L－15。②0.5 mol/L 二甲基亞砜(丙二醇)、0.05 mol/L 蔗糖、10%胎牛血清、L－15。③0.05 mol/L 蔗糖、L－15。④L－15。以上步驟均在37℃水浴鍋內(nèi)完成。

1.2.3 分離提純精子

復(fù)蘇后的附睪組織在含有37℃HTF［22］培養(yǎng)液(200 μL)的EP 管內(nèi)充分剪碎使精液溶解在HTF液中，37℃孵育20 min，輕微震蕩。低速離心1 min(800 r/min.)，37℃孵育10 min，選取上層精液1∶20稀釋，鋪片，顯微鏡下觀察，隨機抽取6 個視野，分別統(tǒng)計鐮刀頭狀精子和運動精子百分比并求均值、方差以及P 值。

1.2.4 熒光染色

按照LIVE/DEAD Sperm Viability Kit 說明書進行實驗操作。鋪片，熒光顯微鏡下觀察。顯微鏡下隨機抽取6 個視野，分別統(tǒng)計綠色和紅色熒光精子百分比并求均值、方差以及P 值。

1.2.5 顯微操作和移植

采集、消化卵子細胞，挑選有第一極體的卵子備用。將上述分離所得上層精子懸浮液(3 μL)加入5% PVP 液滴，調(diào)整參數(shù)分離精子頭并注射到卵子內(nèi)。M16 培養(yǎng)液培養(yǎng)。24 h 后統(tǒng)計2－細胞數(shù)目并輸卵管移植，19～21d 后統(tǒng)計其產(chǎn)仔數(shù)。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行t 檢驗等相關(guān)數(shù)據(jù)分析。P＜0.05 具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 精子形態(tài)

從三種冷凍保護劑(DMSO、PROH、R18S3)冷凍的附睪中分離出的精子在顯微鏡下觀察(圖1，彩插6)。三個實驗組的精子形態(tài)結(jié)構(gòu)均保存完整，87%以上精子為鐮刀狀，DMSO 組7.6%精子仍有運動能力但其游速緩慢、擺尾頻率低，PROH 組4.4%，R18S3組9.2%。故該精子不能用于體外受精必須借助輔助生殖技術(shù)即胞質(zhì)內(nèi)單精子注射以及胚胎移植技術(shù)獲得子代。

2.2 熒光染色

三個實驗組的精子染色，鋪片，熒光顯微鏡下觀察(圖2，彩插6)。R18S3組(16.83 ±6.49)%精子發(fā)綠光即質(zhì)膜完整，PROH 組(88.17 ±3.43)%，DMSO 組(61.17 ±10.65)%。PROH 組、DMSO 組效果明顯優(yōu)于R18S3組，三個實驗組兩兩間差異均有顯著性(P＜0.05)(圖3)。

2.3 顯微操作及胚胎移植

分離提純的三組實驗組精子經(jīng)卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)后可以培養(yǎng)發(fā)育成2－細胞，胚胎移植后可得到小鼠子代個體(表3)。三個實驗組共用10 只假孕母鼠，共產(chǎn)38 只小鼠，其中丙二醇組出生率最低。子一代合籠交配可產(chǎn)生正常子二代。結(jié)果表明冷凍復(fù)蘇后的精子仍具有正常的生殖發(fā)育活性，并且冷凍處理未損傷遺傳物質(zhì)。

圖3 熒光染色后綠色熒光精子的比例Fig.3 Survival rates of sperms after cryopreservation and thawing.Fluorescent staining.

表3 三個實驗組精子ICSI 及胚胎移植結(jié)果Tab.3 Numbers of 2－cell embryos and pups after sperm ICSI and implantation

3 討論

低溫生命凍存是指在－80℃(干冰溫度)至－196℃(液氮溫度)下保存生命結(jié)構(gòu)。而在低溫生命凍存技術(shù)中，玻璃化冷凍技術(shù)應(yīng)用最為廣泛。所謂玻璃化冷凍，是使細胞及其保護劑溶液以足夠快的降溫速率，過冷到所謂玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，而被固化成完全的玻璃態(tài)，并以這種玻璃態(tài)在低溫下長期保存的技術(shù)［1］。目前保護劑分為滲透性(二甲基亞砜、丙二醇等)和非滲透性(蔗糖等)。Keros［10］和Milazzo 等［11］研究發(fā)現(xiàn)冷凍睪丸組織二甲基亞砜的效果要優(yōu)于其他幾種保護劑。本實驗用于冷凍附睪的保護劑中丙二醇冷凍的精子質(zhì)膜破損比例最低(11.83%)，效果優(yōu)于其他兩種冷凍液(R18S3∶83.17%，DMSO∶38.83%)。丙二醇作為冷凍保護劑在小鼠2－細胞胚胎、人類血管平滑肌細胞等低溫保存方面發(fā)揮著重要作用［12］。本實驗結(jié)果表明:丙二醇相比DMSO 和R18S3，更適用于小鼠附睪的冷凍保存。此外，同時使用兩種冷凍保護劑比單獨使用任何一種保護劑的冷凍效果好，更能充分降低保護劑對細胞結(jié)構(gòu)以及功能的影響，一般是滲透性與非滲透性保護劑同時使用［13］。本實驗采用二甲基亞砜、丙二醇等滲透性保護劑和非滲透性保護劑蔗糖，混合作為冷凍保護劑。此外針對每種冷凍保護劑采取相應(yīng)的最優(yōu)平衡條件，因DMSO 溫度越高毒性越大所以0℃平衡而綜合滲透性及毒性等因素PROH宜4℃平衡處理，平衡后統(tǒng)一液氮內(nèi)保存。以前相關(guān)工作中二甲基亞砜以及丙二醇作為保護劑均采用程序快(慢)速降溫［2－9］，但在本實驗中采取一步玻璃化冷凍，熱傳導(dǎo)更快，結(jié)果顯示冷凍效果良好，精子形態(tài)完整、仍具有正常的生殖發(fā)育能力。能夠使卵子受精發(fā)育成2－細胞、4－細胞甚至囊胚。之前程序降溫工作僅僅研究了結(jié)構(gòu)形態(tài)變化并未檢測其生理功能是否完善。本實驗精子經(jīng)ICSI 后的受精率約60%左右，所得的2－細胞胚胎經(jīng)輸卵管內(nèi)移植后均可得到仔鼠(DMSO 組:13 只，PROH 組:8 只，R18S3組:17 只)。子一代7 周齡時按1♀∶1♂進行交配可得到子二代個體，說明子一代具有正常的繁殖性能，以此判定冷凍復(fù)蘇處理并未影響精子的遺傳物質(zhì)。子一代個體數(shù)目較少的原因可能是ICSI操作過程中脈沖級別過大、PVP 濃度過高、PVP 注射進入卵子過多、透明帶損傷等都會影響卵子正常受精以及后續(xù)卵裂發(fā)育;胚胎移植時輸卵管切口位置、大小，多余溶液等影響了胚胎發(fā)育。

為了更直觀的檢測冷凍效果，采用LIVE/DEAD Sperm Viability Kit 試劑盒檢測精子存活率。熒光分子探針染色法、常規(guī)染色及低滲膨脹試驗是目前精子存活率主要評價方法，均應(yīng)用于臨床試驗［14］。本實驗結(jié)果顯示，三個實驗組兩兩之間具有差異性，PROH 組僅有11.83%精子質(zhì)膜破損，明顯低于另外兩組。由于附睪表層致密膜阻礙冷凍劑充分滲透到細胞內(nèi)，使得細胞內(nèi)仍有大量水分存在，極易在冷凍過程中形成內(nèi)外冰晶，以及滲透壓不平衡會對精子內(nèi)部亞細胞結(jié)構(gòu)及細胞膜完整性產(chǎn)生損傷致使精子死亡［15］。為避免此類問題，在進一步的研究中將選擇分子量更小、滲透能力更強的冷凍保護劑，以盡可能的減少對細胞生物活性的影響。

另外還存在著子代個體的主要遺傳物質(zhì)、基因型、關(guān)鍵蛋白表達以及發(fā)育情況是否與正常小鼠一致等問題。冷凍過程中對亞細胞結(jié)構(gòu)例如線粒體的損傷等問題，以及本實驗所用的冷凍保護劑、方法是否適用于其他品系小鼠包括基因工程小鼠和疾病小鼠模型，需要進一步研究。

(本文圖1，2 見彩插6。)

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