唐晶晶，梁德，江曉兵，丁金勇，楊志東，姚珍松，張順聰

(1.廣州中醫(yī)藥大學，廣州 410405;2.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣州 510405)

腰椎間盤突出癥是脊柱退行性疾病中常見的疾病，由于神經壓迫而引發(fā)的神經根痛也是臨床上最嚴重的癥狀之一，雖然導致疼痛的具體機理尚未絕對統(tǒng)一，但機械性壓迫與壓迫介導的炎癥反應、神經根水腫已被認為是其主要的發(fā)病機理［1-2］。因此，在腰椎間盤突出癥的相關動物實驗中，大多數(shù)學者都是通過建立神經根壓迫動物模型來模擬其發(fā)病機理，其模擬效果得到了驗證。根據(jù)文獻描述，他們的方法多是通過全椎板切除來完成造模。我們在實踐過程中，發(fā)現(xiàn)全椎板切除造模法導致大鼠的組織損傷及失血量較大，同時部分大鼠術后恢復情況較差，存在一定的死亡率。本研究將造模方式改變?yōu)榘胱蛋迩谐?，并在研究中對比半椎板法與全椎板法在建立大鼠腰神經根壓迫模型上的有效性及其他特點，以期為臨床治療腰椎間盤突出癥提供科學依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級SD 大鼠40 只，5～7 周齡，體重(250 ±20)g，雌雄各半，購于廣州中醫(yī)藥大學動物中心【SCXK(粵)2013-0020】。無菌手術在廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗動物中心屏障動物實驗設施進行【SYXK(粵)2010-0092】，飼養(yǎng)溫度22 ±3℃，濕度55%～75%，自然光節(jié)律，并按實驗動物使用的3R 原則給予人道關懷。

1.2 建立大鼠腰神經根壓迫模型

采用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，麻醉滿意后，剪毛、固定、消毒、鋪巾。實驗組以L4/5 椎體間隙為中心，取后背正中切口偏左，長約3～4 cm，鈍性剝離背伸肌達椎板，暴露大鼠左側脊柱椎板結構，不損傷棘突及對側組織，隨后切除左側關節(jié)突和椎板，暴露硬膜囊及左側L5 神經根，將(32±1.5)mg 的硅膠管片置于L5 神經根與硬膜囊交界處的腋部(見圖1)。對照組則以L4/5 椎體間隙為中心，取后背正中切口，長約3～4 cm，鈍性剝離背伸肌達兩側椎板，剪除L4、5 棘突，咬除全部椎板，充分暴露硬膜囊及左側L5 神經根，將(32 ±1.5)mg的硅膠管片置于L5 神經根與硬膜囊交界處的腋部。兩組局部固定后，逐層縫合(見圖2)。術后待動物蘇醒后，放入籠中觀察。(圖1，2 見彩插5。)

1.3 觀察指標

1.3.1 建模手術時間

在手術過程中詳細記錄了每一只動物模型所需的操作時間，并進行比較。

1.3.2 傷口愈合狀態(tài)

觀察并記錄兩組腰神經根壓迫模型大鼠在第6天傷口愈合的狀態(tài)，運用以下評分標準，進行統(tǒng)計學比較。0 分:傷口無紅腫，色澤正常，血性滲出物不明顯，創(chuàng)面瘢痕纖細，基本無攣縮，愈合良好。1 分:傷口略紅腫或腫脹，有少量血腥滲出液，創(chuàng)面瘢痕纖細，基本無攣縮，愈合良好。2 分:傷口發(fā)紅，血性滲出物多，血痂明顯，瘢痕明顯，愈合差。3 分:傷口感染，瘢痕較重，延期愈合。

1.3.3 建模術中出血量

采用無菌醫(yī)用棉簽進行止血，并通過計算棉簽的數(shù)量來估算建模手術中的出血量，并進行組間比較。

1.3.4 大鼠死亡率

觀察并記錄造模后2 周內兩組腰神經根壓迫模型大鼠每天的死亡數(shù)量，計算每天的死亡率，進行統(tǒng)計學比較。

1.3.5 左下肢神經功能

為確定造模是否成功，評估大鼠左下肢的神經功能變化，采用Siegal［3］推薦的神經功能判斷六級分法:0 級，正常;1 級，尾無力;2 級:后肢無力，行走具有輕度困難;3 級:后肢無力，行走具有明顯不穩(wěn)定性;4 級:站立不穩(wěn)，后肢能夠移動;5 級:癱瘓，后肢無自主移動。每日觀察2 次。采用神經功能分值進行統(tǒng)計分析(t 檢驗)，0 級:2 分;1 級:4 分;2 級:6分;3 級:8 分;4 級:10 分;5 級:12 分。

1.3.6 病理組織觀察

采用日本Olympus 顯微鏡觀察神經根組織的病理改變并攝影，采用免疫組化法測定TNF-α 及IL-1在細胞質中灰度值表達水平。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

采用SPSS 13.0 數(shù)據(jù)處理軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，數(shù)據(jù)結果采用均數(shù)±標準差表示。組間數(shù)據(jù)比較采用t 檢驗或者One-WAY 分析，以P＜0.05 為有顯著性統(tǒng)計學差異，以P＜0.01 為有極顯著性差異。

2 實驗結果

2.1 建模手術操作時間

通過統(tǒng)計學(t 檢驗)分析，兩組建模手術的耗時存在明顯的差異，差異有顯著性(P＜0.01)，實驗組的耗時明顯短于對照組(表1)。

2.2 傷口愈合狀態(tài)

通過統(tǒng)計學計算對比評分值，發(fā)現(xiàn)兩組評分差異有顯著性(P＜0.01)，可以判定實驗組大鼠在第3 天傷口愈合的狀態(tài)優(yōu)于對照組(見表1)。

2.3 建模術中出血量

采用無菌醫(yī)用棉簽(生產廠家:佛山市順德區(qū)康正衛(wèi)生材料有限公司)壓迫止血，并通過計算使用的棉簽數(shù)量，評估每只大鼠的出血量，通過統(tǒng)計學分析(t 檢驗)，兩組在出血量的比較上存在明顯差異，且差異具有顯著性(P＜0.01)，實驗組大鼠手術過程中出血量明顯少于對照組(見表1)。

2.4 左下肢神經功能

術后兩組大鼠都出現(xiàn)左下肢下垂，右下肢收縮，伴跛行步態(tài)。左下肢神經功能異常均在2 級以上，并在術后14 天內呈現(xiàn)進行性加重的傾向。根據(jù)神經功能六級分法測定每只大鼠神經功能分值，并進行統(tǒng)計學分析。分析結果表明，建模術后，實驗組和對照組大鼠左下肢神經功能無明顯差異，差異無顯著性(P ＞0.01)(見表1)。

2.5 大鼠死亡率

觀察并記錄兩組腰神經根壓迫模型大鼠的死亡數(shù)量，進行統(tǒng)計學比較(見表1)。

表1 不同觀察指標結果(±s，n=20)Tab.1 Results of measurement of some parameters in the rats

表1 不同觀察指標結果(±s，n=20)Tab.1 Results of measurement of some parameters in the rats

注:a:代表與對照組相比較，P＜0.05，b:代表與對照組相比較，P ＞0.05Note:a:vs.control group，P＜0.05;b:vs.control group，P ＞0.05.

組別Groups操作時間Operation time傷口愈合評分Healing scores棉簽數(shù)量No.of swabs神經功能Neural function死亡率Mortality rate實驗組Experimental9.70 ±1.129a0.55 ±0.686a3.9 ±0.641a7 ±2.2b0.05 ±0.224a對照組Control16.95 ±1.9051.55 ±1.1467.6 ±1.3147.7 ±2.3460.25 ±0.444

2.6 病理改變及TNF-α 及IL-1 灰度值表達

2.6.1 病理組織觀察

光鏡顯示造模后，硅膠管片壓迫的兩組大鼠的脊髓膜、神經根組織及其小血管擴張充血明顯，神經根外形改變并偏移、形態(tài)扭曲甚至壓縮，周圍結締組織增生明顯，與神經根粘連明顯，同時還表現(xiàn)出血、細胞腫脹、氏體消失及大量炎性細胞浸潤，囊性變，空洞形成，神經元數(shù)量減少，兩組大鼠神經根組織病理改變無明顯差異(圖3 見彩插5)。

2.6.2 神經根組織TNF-α 及IL-1 在細胞質中灰度值表達水平

通過統(tǒng)計學分析，兩組神經根組織在TNF-α 細胞質灰度值的比較上差異無顯著性(P ＞0.05)，在IL-1 細胞質灰度值的比較上差異無顯著性(P ＞0.05)。(見表2、圖4 見彩插5。)

表2 兩組大鼠神經根組織的灰度值表達結果(±s，n=20)Tab.2 Results of gray scales in nerve root tissues of the rats in tow groups

表2 兩組大鼠神經根組織的灰度值表達結果(±s，n=20)Tab.2 Results of gray scales in nerve root tissues of the rats in tow groups

注:a:代表與對照組相比較，P ＞0.05。Note:a:vs.control group，P ＞0.05.

組別Groups TNF-α 灰度值TNF-α grey scales IL-1 灰度值IL-1 grey scales實驗組Experimental0.4612 ±0.1235a0.3524 ±0.0631a對照組Control0.4586 ±0.08560.338 ±0.062

3 討論

由腰椎椎間盤突出所致的神經根壓迫癥是臨床常見病、多發(fā)病。目前，國內外學者正從已建立的動物模型［4-5］身上來研究神經根受壓后形態(tài)學方面的改變，對神經根壓迫癥的發(fā)病機理進行了較多研究。如王擁軍等［6］用硅膠片壓迫大鼠L5 神經根，并在不同時間段觀察到神經根纖維組織出現(xiàn)不同的病理改變。然而，大多數(shù)的文獻研究都是針對神經根壓迫癥的病因病理、發(fā)病機制或藥物干預等方面，而對于原有的建立神經根壓迫動物模型方法進行改良的研究卻鮮見報道。本研究旨在探討改良半椎板切除法在建立大鼠腰神經根壓迫模型中的特點和優(yōu)勢，通過觀察建模手術時間、術中出血量、傷口愈合狀態(tài)、死亡率等動物倫理學相關指標以及大鼠下肢神經功能、神經根組織病理改變、TNF-α 與IL-1 在細胞質中灰度值表達水平等驗證造模成功的相關指標來對比改良方法與傳統(tǒng)方法的異同。

依據(jù)統(tǒng)計學分析，改良半椎板切除法在建立大鼠腰神經根壓迫模型在建模時間、出血量、傷口的紅腫、血痂、攣縮及瘢痕等癥狀愈合狀態(tài)及死亡率上明顯優(yōu)于全椎板切除法，建模手術時間縮短，能加快建模操作速度，有利于增加大鼠模型的數(shù)量，提高工作效率。同時，手術創(chuàng)口小，建模術中出血少，傷口的紅腫、血痂、攣縮及瘢痕等癥狀愈合快，組織破壞少，則可以明顯提高大鼠的生存率，同時能夠減低建模術后大鼠感染的概率，降低死亡率，提高了實驗的效率，從動物倫理層面，實驗組采用單側皮膚小切口，對動物的組織結構破壞少，減低動物在實驗中遭受過多的痛苦，更好地關注了動物倫理因素。

此外，從建模術后神經功能的觀察上發(fā)現(xiàn)兩組大鼠都出現(xiàn)明顯的單側下肢神經功能障礙，如單側下肢下垂，行走不穩(wěn)伴跛行步態(tài)等［7］，并在術后短期內呈現(xiàn)進行性加重，統(tǒng)計結果表明兩組神經功能分值無明顯差異，可證實兩組大鼠建模術后的神經功能變化具有明顯的相似性。在造模后的病理學改變上，相關研究證實［8］，神經根也存在血-神經屏障，受壓后可造成神經根血-神經屏障的破壞和神經內水腫。本研究中，病理組織學觀察發(fā)現(xiàn):建模術后兩組大鼠的神經根組織及其小血管擴張充血、水腫明顯，神經根外形改變并偏移、形態(tài)扭曲甚至壓縮，周圍結締組織增生明顯，與神經根粘連明顯。在建模術后神經根組織病理組織學的變化上，改良法與傳統(tǒng)法無明顯差異，兩組大鼠在病理組織學上具有相似的表現(xiàn)。另外，神經根受壓后，神經血管通透性增高、血-神經屏障破壞，血管血流量下降、炎癥細胞游出釋放炎癥介質如白介素-1(IL-1)，腫瘤壞死因子(TNF-a)等。這些炎癥介質能促進細胞浸潤引起炎癥和組織損傷，特別是IL-1 能增加PGE2(前列腺素E2)的產生［9］。這些炎癥介質的表達水平在神經根受壓的情況下都會上升，明顯高于正常水平，可使組織對其他致痛物質的敏感性增加［10-11］。因此，本研究也通過免疫組化法來分析兩組大鼠受壓神經結構白介素-1(IL-1)及腫瘤壞死因子(TNF-a)在細胞質中灰度值的表達水平，研究發(fā)現(xiàn)兩組中IL-1 及TNFa 都要明顯高于正常水平，而且兩組的神經根組織細胞質中TNF-α 及IL-1 灰度值表達無明顯差異。這更說明兩組的神經根壓迫模型建造效果相似，兩種建模方法都能夠取得理想的實驗結局。

綜上所述，通過實驗表明，改良半椎板切除法與全椎板切除法在建立大鼠神經根壓迫模型都能夠取得良好的效果，運用兩種方法建模后，大鼠的下肢神經功能出現(xiàn)明顯減低，病理組織學都顯示神經根組織出現(xiàn)不同的病理改變，TNF-α 及IL-1 的表達都明顯高于正常水平，以上相關指標都是評估大鼠神經根壓迫模型的重要標準，通過免疫組化學檢測及統(tǒng)計學分析，兩組指標無明顯統(tǒng)計學差異，表明兩種建模方法都能取得理想的建模效果。然而，統(tǒng)計學分析表明，在建模的操作時間、動物出血量、傷口愈合情況、組織破壞程度上、動物死亡率及動物倫理方面，實驗組明顯優(yōu)于對照組，這表明改良半椎板切除法在建立大鼠神經根壓迫模型中具有手術時間短，出血量少，傷口的紅腫、血痂、攣縮及瘢痕等癥狀愈合快，組織結構破壞少，死亡率低等優(yōu)勢，同時，小切口操作，組織結構破壞少，減少動物在建模手術過程中遭受不必要的痛苦。

(本文圖1～4 見彩插5。)

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