張 鏡,劉少娜，黃思梅

(嘉應(yīng)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 梅州 514015)

短穗魚(yú)尾葵(Caryotamitis)，又稱叢生魚(yú)尾葵、酒椰子，為棕櫚科魚(yú)尾葵屬常綠小喬木，高5-8米.喜溫暖，生長(zhǎng)適宜溫度為18℃-30℃，較耐寒，對(duì)光線適應(yīng)性強(qiáng)，抗旱能力較強(qiáng)，中國(guó)南方種植數(shù)量大.目前，短穗魚(yú)尾葵主要用于綠化、觀賞及肉質(zhì)莖的加工等[1].短穗魚(yú)尾葵果實(shí)產(chǎn)量高，且?guī)缀踅K年果實(shí)次第成熟.文獻(xiàn)表明短穗魚(yú)尾葵果實(shí)內(nèi)總酚含量很高[2]，原花青素的含量亦豐富，是開(kāi)發(fā)天然活性產(chǎn)物難得的資源[3].迄今，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)短穗魚(yú)尾葵果實(shí)原花青素分離純化的研究報(bào)道.

大孔吸附樹(shù)脂具有穩(wěn)定性高、選擇性強(qiáng)、處理量大、再生方便等優(yōu)點(diǎn)，在天然活性產(chǎn)物工業(yè)化提取分離中廣泛應(yīng)用[4～6].本研究以5種大孔吸附樹(shù)脂供試，從中篩選出對(duì)短穗魚(yú)尾葵果實(shí)原花青素吸附量大、解吸率高的樹(shù)脂種類，研究其吸附量與解吸率的主要影響因子，獲得短穗魚(yú)尾葵果實(shí)原花青素大孔吸附樹(shù)脂純化的技術(shù)條件，為其原花青素資源開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

采摘果皮顏色褪綠及淡紅色短穗魚(yú)尾葵果實(shí)，剔除雜質(zhì)和腐爛變質(zhì)的果實(shí)，自來(lái)水洗凈后晾干果面余水，冷凍干燥，粉碎，80目過(guò)篩粉末低溫保存?zhèn)溆?

試驗(yàn)用乙醇、正丁醇、HCl、NaOH、FeNH4(SO4)2·12H2O等，均為分析純.供試的DS401、AB-8、D101、DA201、DM301，均為天津樹(shù)脂廠生產(chǎn).

1.1.2 儀器與設(shè)備

BT2KXL 凍干機(jī)(美國(guó)Virtis公司)；U-2800 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本日立公司)； PHS-2C 酸度計(jì)(上海智光儀器表有限公司)；FA2004 電子分析天平(上海精天電子儀器廠)；JLL28-B 低速大容量多管離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠).

1.2 供試樣品的制備

1.2.1 原花青素粗提物

短穗魚(yú)尾葵果實(shí)粉末與75%乙醇溶液(pH=2)以1:5的料液比混合，室溫浸提2.5h，4500r/min離心20min，上清液冷凍干燥得棕紅色粉末狀原花青素粗提物.

1.2.2 原花青素的含量測(cè)定

以鐵鹽催化法進(jìn)行原花青素顯色及測(cè)定含量[7].取1 mL原花青素粗提物溶液于比色管中，依次加入6 mL正丁醇-鹽酸溶液(95:5，V/V)及0. 2mL 2%硫酸鐵銨溶液，沸水浴40min后迅速冷卻，以蒸餾水代替樣液為參比，測(cè)定處理液A546nm值，按公式(1)與(2)計(jì)算原花青素的含量(%)及原花青素的質(zhì)量(mg)

(1)

(2)

注：y—原花青素含量/%；x—原花青素質(zhì)量/mg； A 546nm吸光度；V—稀釋倍數(shù)；

W—樣品質(zhì)量(mg)；0. 366—A1%1 cm在546 nm處原花青素的吸光度.

按上述方法測(cè)定供試粗提物樣品原花青素的含量為10.446%

1.3 大孔吸附樹(shù)脂的篩選

1.3.1 供試樹(shù)脂的靜態(tài)吸附

準(zhǔn)確稱取樹(shù)脂濕基2.0g裝入150mL三角瓶中，加入2.0%原花青素粗提物(原花青素含量為0.209%)樣液50mL，25℃、120r/min振蕩12h，充分吸附后測(cè)定溶液吸光值，按公式(3)及(4)計(jì)算樹(shù)脂吸附量與吸附率.

Qe=(C0-C1)V/W，

(3)

Ee(%)=(C0-C1)/C0×100.

(4)

注：Qe-樹(shù)脂吸附量(mg/g)；C0-吸附前溶液中原花青素的質(zhì)量濃度(mg/mL)；C1-吸附后溶液中原花青素的質(zhì)量濃度(mg/mL)；V-溶液體積(mL)；W-樹(shù)脂濕重(g)；Ee-吸附率.

1.3.2 吸附原花青素的解吸試驗(yàn)

取1.0g原花青素吸附飽和樹(shù)脂于150mL三角瓶中，各加入70%乙醇溶液50mL，保鮮膜封口，25℃、120r/min振蕩12h，取樣測(cè)定溶液的吸光值，按公式(4)及(5)計(jì)算樹(shù)脂的解吸量與解吸率.

(5)

Ed(%)=Qe/Qd×100.

(6)

注：Qd-樹(shù)脂解吸量(mg/g)；C2-解吸液中原花青素的質(zhì)量濃度(mg/mL)；V-溶液體積(mL)；Ed-解吸率.

1.4 樹(shù)脂吸附性能的主要影響因素

1.4.1 溫度與吸附量的關(guān)系

準(zhǔn)確稱取樹(shù)脂濕基2.0g裝入150mL三角瓶中，加入1.0%原花青素粗提物樣液50mL，分別置于溫度設(shè)置為15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃振蕩器，振蕩120r/min，每30min取樣，正丁醇-鹽酸顯色后測(cè)定處理液A546nm值.

1.4.2 溫度與吸附平衡時(shí)間的關(guān)系

準(zhǔn)確稱取樹(shù)脂濕基1.0g裝入150mL三角瓶中，加入1.0%原花青素粗提物樣液50mL，分別置于溫度設(shè)置為15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃振蕩器，振蕩120r/min，每30min取樣，正丁醇-鹽酸顯色后測(cè)定處理液A546nm值.

輸變電工程時(shí)間長(zhǎng)，假如沒(méi)有提前對(duì)其成本實(shí)施管理，那么就可能會(huì)使得部分居心不良的人鉆了空子，對(duì)施工成本進(jìn)行虛報(bào)，大發(fā)不義之財(cái)，因此，我們必須改變傳統(tǒng)的成本管理理念，創(chuàng)新管理方式，開(kāi)源節(jié)流，減少施工成本。遵循成本控制原則，對(duì)于施工的每一個(gè)階段，都要有專人負(fù)責(zé)監(jiān)督和記錄，以防出現(xiàn)內(nèi)部虧空，對(duì)整個(gè)工程進(jìn)度產(chǎn)生不良影響。要規(guī)范財(cái)務(wù)管理流程，財(cái)務(wù)部門(mén)應(yīng)該實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化管理，并不斷對(duì)管理與控制體系進(jìn)行優(yōu)化。

1.4.3 pH與樹(shù)脂吸附量的關(guān)系

準(zhǔn)確稱取樹(shù)脂濕基1.0g裝入150mL三角瓶中，分別加入pH =1、2、3、4、5、6、7、8和9的1.0%原花青素粗提物溶液50mL，置于振蕩器內(nèi)25℃、120r/min振蕩6h，正丁醇-鹽酸顯色后測(cè)定處理液A546nm值，計(jì)算吸附量.

1.5 樹(shù)脂吸附原花青素的解吸

1.5.1 乙醇濃度與解吸效果的關(guān)系

準(zhǔn)確稱取1.0g已吸附原花青素的樹(shù)脂濕基裝入150mL三角瓶中，分別加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液50mL，25℃、120r/min振蕩12h，測(cè)定處理液A546nm值.

1.5.2 溫度對(duì)解吸性能的影響

準(zhǔn)確稱取1.0g已吸附原花青素的樹(shù)脂濕基裝入150mL三角瓶中，加入90%乙醇溶液50mL，于設(shè)定溫度下120r/min振蕩12h，取樣正丁醇-鹽酸顯色后測(cè)定處理液A546nm值.

1.5.3 pH對(duì)解吸性能的影響

準(zhǔn)確稱取1.0g已吸附原花青素的樹(shù)脂濕基裝入150mL三角瓶中，分別加入不同pH 值的90%乙醇溶液50mL，25℃、120r/min振蕩12h，正丁醇-鹽酸顯色后測(cè)定處理液A546nm值.

1.5. 4 解吸正交試驗(yàn)

分別稱取已吸附原花青素的樹(shù)脂濕基1.0g，以解吸溫度、乙醇濃度及溶液的pH值進(jìn)行3因素、3水平正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

注：A.溫度/℃，B.乙醇濃度/%，C.pH值

1.6 吸附原花青素的動(dòng)態(tài)解吸試驗(yàn)

樹(shù)脂與10%原花青素粗提物溶液按1:10比例混合，25℃吸附6h后取出,以2倍體積的蒸餾水漂洗60s,準(zhǔn)確稱取20g吸附飽和的樹(shù)脂裝入2cm×10cm的層析柱，分別以0.50、0.75、1.00、1.25及1.50倍柱床體積流速洗脫，以10mL為1流份收集洗脫液，共收集15流份，洗脫液正丁醇-鹽酸顯色后測(cè)定處理液A546nm值.

1.7 處理重復(fù)及數(shù)據(jù)分析

各處理重復(fù)3次，以SPSS 11.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，3次重復(fù)數(shù)據(jù)平均值以excel作圖，以Duncans'法進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.0 5 表示差異顯著，P<0.0 1表示差異極顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 供試樹(shù)脂的吸附量與解吸率

5種樹(shù)脂對(duì)短穗魚(yú)尾葵果實(shí)原花青素均具有一定的吸附能力，其中AB-8與DS401的吸附能力與解吸能力較好，2種樹(shù)脂的吸附量45.29、45.42 mg/g，差異不顯著.其次是D101，吸附量42.24mg/g，與上述2樹(shù)脂差異顯著.樹(shù)脂DA201及DM301的吸附量更低.AB-8與DS401樹(shù)脂上的短穗魚(yú)尾葵果實(shí)原花青素的解吸率高，分別為87.89%及89.91%，兩者無(wú)顯著差異.而D101、DA201及DM301樹(shù)脂上的原花青素的解吸率均較低(表2).表明弱極性的大孔吸附樹(shù)脂AB-8與DS401都較適合短穗魚(yú)尾葵果實(shí)原花青素的純化，其中DS401樹(shù)脂上原花青素的解吸率更高，故以DS401樹(shù)脂純化短穗魚(yú)尾葵果實(shí)原花青更佳.

雖然DS401與AB-8在25℃下對(duì)短穗魚(yú)尾葵果實(shí)原花青素的飽和吸附量相當(dāng)，但AB-825℃下對(duì)山竹殼原花青素的靜態(tài)飽和吸附達(dá)76.40mg/g[8]，高于對(duì)短穗魚(yú)尾葵果實(shí)原花青素吸附量，表明短穗魚(yú)尾葵果實(shí)原花青素與山竹殼原花青素為結(jié)構(gòu)不同的原花青素.

表2 供試樹(shù)脂靜態(tài)吸附與解吸效果

2.3 溫度與原花青素吸附量與吸附平衡時(shí)間的關(guān)系

2.3.1 溫度對(duì)原花青素吸附量

圖1表明在15℃～50℃內(nèi)DS401樹(shù)脂對(duì)原花青素的吸附量隨溫度的升高而增大，45℃的吸附量為65.637mg/g、50℃的吸附量67.791為mg/g，其吸附分別為25℃吸附量的133.937%及138.332%，兩者差異不顯著.但50℃吸附量較35℃吸附量的差異顯著、較30℃以下的差異極顯著.試驗(yàn)結(jié)果與張澤生等的研究結(jié)果相近[9]，而DS401對(duì)短穗魚(yú)尾葵原花青素的吸附量低于AB-8對(duì)山楂果中原花青素的吸附量[6].而LS300大孔吸附樹(shù)脂樹(shù)脂對(duì)月柿原花青素的吸附50℃的吸附量幾乎較30℃的吸附量高1倍[10]，兩者差異遠(yuǎn)大于本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，表明短穗魚(yú)尾葵原花青素的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同于上述2類原花青素.

圖1溫度與吸附量的關(guān)系

結(jié)果表明吸附體系的溫度對(duì)原花青素在固相與液相的分配影響極大，提高吸附體系的溫度可明顯提高樹(shù)脂對(duì)原花青素的吸附量，降低吸附后液中原花青素的殘留量，有利于提高穗魚(yú)尾葵原花青素的得率.

2.3.2 溫度對(duì)原花青素吸附平衡時(shí)間的關(guān)系

DS401樹(shù)脂1g濕基與1%短穗魚(yú)尾葵原花青素粗提取物50mL混合，不同溫度下進(jìn)行靜態(tài)吸附結(jié)果如圖2所示.由圖2 看出溫度與吸附平衡時(shí)間的關(guān)系是在15～30℃內(nèi)，溫度越低吸附平衡時(shí)間越長(zhǎng)，當(dāng)溫度升為30℃時(shí)吸附平衡時(shí)間由15℃的7h縮短為4.5h，但在35～50℃吸附溫度對(duì)吸附平衡時(shí)間無(wú)明顯的影響，吸附平衡時(shí)間與30℃無(wú)明顯差異.表明吸附體系的溫度30℃以上時(shí)，吸附平衡時(shí)間為4.5h.

圖2溫度與吸附平衡時(shí)間的關(guān)系

2.4 pH對(duì)吸附性能的影響

由圖3可知，當(dāng)原花青素粗提物溶液的pH在1～5時(shí)，樹(shù)脂對(duì)原花青素的吸附量隨pH值增大而提高，pH5時(shí)對(duì)原花青素的吸附量為56.52mg/g，但當(dāng)pH值繼續(xù)上升時(shí)，吸附量先下降后在pH8時(shí)又開(kāi)始上升，pH9時(shí)的吸附率52.04mg/g，且與pH7的吸附量差異顯著(p > 0.05).這與大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的植物活性物質(zhì)要達(dá)到較好的吸附效果一般是在酸性條件下被吸附具明顯差異[11～12].有文獻(xiàn)報(bào)道原花青素的穩(wěn)定性受pH影響，在堿性條件下不穩(wěn)定，隨著pH的升高易發(fā)生分解[13]，使吸附后液的吸光值降低，從而造成計(jì)算所得的吸附量增加，而DS401樹(shù)脂對(duì)短穗魚(yú)尾葵原花青素的吸附量在pH9時(shí)大于pH7的吸附量，顯然不是由于堿性條件下原花青素的分解，而應(yīng)該與原花青素的性質(zhì)有關(guān).

圖3不同pH對(duì)吸附效果的影響系

2.5 溫度對(duì)原花青素解吸的影響

吸附原花青素的DS401樹(shù)脂不同溫度解吸試驗(yàn)的結(jié)果如圖4所示，在15℃～45℃溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的上升解吸液的吸光值升高，45℃解吸解吸液的吸光度為0.981，50℃解吸解吸液的吸光度值為0.846，較前者低13.761%.45℃解吸解吸液的吸光度較40℃與50℃解吸解吸液的差異均極顯著(p > 0.01).

圖4不同溫度對(duì)解析效果的影響系

2.6 pH對(duì)解吸的影響

pH7時(shí)解吸液靜態(tài)解吸DS401吸附的原花青素，溶液的吸光值1.171，為各處理間的最大吸光度，與其余處理吸光度的差異極顯著，結(jié)果表明中性條件有利于DS401吸附的短穗魚(yú)尾葵果實(shí)原花青素的解吸，與文獻(xiàn)報(bào)道原花青素以洗脫液pH=6.3為適宜洗脫條件的結(jié)果相似[14].

圖5不同pH值對(duì)解析效果的影響系

2.7 乙醇濃度對(duì)解吸的影響

從圖6看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)在30%～70%范圍內(nèi)，解吸液吸光值變化明顯，各處理的吸光值差異顯著(p > 0.05)，而乙醇體積分?jǐn)?shù)在70%～90%后吸光值增加不明顯，結(jié)果表明乙醇體積分?jǐn)?shù)70%解吸原花青素的效果最佳.

圖6不同濃度洗脫液的解析效果

2.8 靜態(tài)解吸正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因子試驗(yàn)結(jié)果，以解吸溫度、乙醇濃度及解吸液 pH值進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn).結(jié)果表明極差最大的是解吸液乙醇的濃度，即是不同濃度乙醇解吸效果差異最大，其次是解吸的溫度.試驗(yàn)結(jié)果顯示，靜態(tài)解析最優(yōu)條件組合為A3B2C2，即在乙醇濃度為80%、溫度45℃及洗脫液pH=8(表3).雖此解吸條件的解吸效果為佳，但若解吸液直接干燥，因除去溶劑后NaOH仍存留于干燥物內(nèi)，干燥物將為強(qiáng)堿性對(duì)提取的原花青的穩(wěn)定性極為不利，因而干燥前解吸液的pH應(yīng)先以HCl調(diào)為中性.

表3 原花青素解吸正交試驗(yàn)結(jié)果

2.9 動(dòng)態(tài)解吸試驗(yàn)結(jié)果

吸附原花青素的樹(shù)脂裝入層析柱內(nèi)，洗脫液流速與原花青素的解吸效果如圖7所示.洗脫速率越小原花青素的洗脫峰越窄，洗脫效果越好.以0.5倍柱床體積流速洗脫中第7～10流份的流出液中原花青素的共842.61mg，占15流份原花青素總936.30 mg的89.99%，且洗脫峰無(wú)明顯拖尾，主峰洗脫總體積約為柱床體積的2倍，至第10流份洗脫液收集結(jié)束的洗脫耗時(shí)5h.而0.75BV/h積流速洗脫中第5～9流份的洗脫液原花青素的共879.24mg，占15流份原花青素總936.31mg的93.90%，主峰洗脫總體積為柱床體積的2.5倍，至第9流份洗脫液收集結(jié)束的洗脫耗時(shí)4.5h，其原花青素的洗脫峰形亦較好，僅稍有拖尾.而1BV/h、1.25 BV/h及1.5BV/h洗脫的都拖尾明顯.流速0.75BV/h的洗脫峰形雖較0.5BV/h的寬，但解吸的時(shí)間較短，且原花青素的回收率較高，因而解吸流速以0.75BV/h較為理想.

圖7不同流速對(duì)解析效果的影響

3 討論與結(jié)論

3.1 短穗魚(yú)尾葵原花青素純化靜態(tài)吸附為宜

以乙醇浸提短穗魚(yú)尾葵果實(shí)原花青素，當(dāng)除去提取液有機(jī)溶劑后具較多的溶性沉淀.若提取液以大孔吸附樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附分離原花青素，需要在回收溶劑后先離心、或過(guò)濾進(jìn)行固液分離，然后才能將液體上柱.以靜態(tài)吸附法分離原花青素不僅可在溶劑回收后的提取液直接加入樹(shù)脂進(jìn)行吸附，而且更容易控制吸附體系的溫度，提高樹(shù)脂原花青素的吸附量.所以，短穗魚(yú)尾葵果實(shí)原花青素提取液原花青素的分離純化以樹(shù)脂靜態(tài)吸附的工藝更適.

3.2 短穗魚(yú)尾葵原花青素樹(shù)脂純化參數(shù)

研究表明DS401弱極性大孔吸附樹(shù)脂對(duì)短穗魚(yú)尾葵果實(shí)原花青素的吸附量最高、解吸效果最佳，是短穗魚(yú)尾葵果實(shí)原花青樹(shù)脂純化的適宜樹(shù)脂.DS401樹(shù)脂靜態(tài)吸附短穗魚(yú)尾葵原花青素在45℃、pH=5下吸附4.5h時(shí)的吸附飽和.樹(shù)脂吸附的原花青素以80%乙醇、pH=8、溫度45℃、0.75VB/h解吸效果最好，從流出解吸液體積達(dá)柱床體積2.5～4.5倍內(nèi)的洗脫液，原花青素的回收率為93.90%.

3.3 短穗魚(yú)尾葵原花青素性質(zhì)的特殊性

DS401大孔吸附樹(shù)脂在25℃下對(duì)短穗魚(yú)尾葵原花青素的飽和吸附量，較AB-8相同溫度對(duì)山竹殼原花青素的態(tài)飽和吸附量低40.72%[8]；大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的植物活性物質(zhì)要吸附效果以較低的pH下更好[11、12]，DS401樹(shù)脂吸附短穗魚(yú)尾葵原花青素在吸附液pH=5時(shí)量最大，而且pH=9的吸附量pH=5時(shí)吸附量?jī)H低7.93%，而高于pH值為6～8內(nèi)的吸附.原花青素的穩(wěn)定性受pH影響，在堿性條件下不穩(wěn)定，隨著pH的升高易發(fā)生分解[13]，而DS401樹(shù)脂對(duì)短穗魚(yú)尾葵原花青素的吸附量在pH=9時(shí)大于pH=7的吸附量.以上結(jié)果表明短穗魚(yú)尾葵原花青素可能其性質(zhì)與常見(jiàn)報(bào)道的其它原花青的性質(zhì)與結(jié)構(gòu)有較大的差別.

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