楊 培 李雪春 林龍飛 田晶辰 倪 健

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京，100029）

基于代謝組學(xué)技術(shù)的白金膠囊治療抑郁癥的研究

楊 培 李雪春 林龍飛 田晶辰 倪 健

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京，100029）

目的：利用代謝組學(xué)技術(shù)探討白金膠囊治療抑郁癥的機(jī)制。方法：以SD大鼠為研究對象，采用慢性不可預(yù)知應(yīng)激制備抑郁大鼠模型。在進(jìn)行腦代謝組學(xué)研究之前，采用體質(zhì)量、糖水消耗量、曠場試驗(yàn)測定結(jié)果為指標(biāo)評價(jià)建模效果和白金膠囊抗抑郁療效。腦代謝組學(xué)研究采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合SPSS、SIMACA-P軟件分析測定結(jié)果，通過數(shù)據(jù)庫（MASSBANK、METLIN、HMDB和KEGG）檢索和文獻(xiàn)分析，尋找出和抑郁相關(guān)的腦組織樣本中的生物信息。結(jié)果：測得腦組織樣本中共1 194種化合物。PCA和OPLS-DA分析結(jié)果顯示，得分矩陣中的空白組、模型組和藥物組分別集中分布在3個(gè)不同區(qū)域，說明存在組間差異；結(jié)合載荷矩陣和VIP值進(jìn)行搜庫查詢及文獻(xiàn)分析，得到牛磺酸、蘇糖酸、N-乙酰天冬氨酸和肌苷4個(gè)主要化合物。結(jié)論：白金膠囊的抗抑郁藥效與其改變腦內(nèi)氨基酸水平、作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)及參與能量代謝有關(guān)。

代謝組學(xué)；液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)；抑郁

生物標(biāo)志物包含著可能改善人類生存環(huán)境的信息。通過提供更早、更精確的診斷測試基礎(chǔ)依據(jù)，生物標(biāo)志物可以幫助臨床醫(yī)生發(fā)現(xiàn)和治療疾病。同時(shí)，其作為終端替代物，還可以幫助研發(fā)出更好更多的目標(biāo)藥物來治療疾病。尋找生物標(biāo)志物遵循一定的聯(lián)系統(tǒng)一性，從開始發(fā)現(xiàn)到鞏固結(jié)束，經(jīng)過證實(shí)的生物標(biāo)志物可以廣泛地使用在臨床應(yīng)用中。例如，心臟衰竭可以通過測量B-natriuretic peptide水平來進(jìn)行精確診斷［1-2］，某些類型的癌癥篩查和監(jiān)測可以通過特定的腫瘤標(biāo)志物實(shí)現(xiàn)［3-4］。對于抑郁癥這樣一種暫無實(shí)驗(yàn)室診斷指標(biāo)的疾病來說，生物標(biāo)志物的研究不僅有助于抑郁癥的診斷和治療，對于抗抑郁藥物的研發(fā)具有重要的意義。已有研究表明，重癥抑郁患者外周系統(tǒng)中脂類和氨基酸類成分的濃度水平出現(xiàn)了異常的變化［5］。代謝組學(xué)的研究能夠?qū)ふ页鲇谝钟艏膊∠嚓P(guān)的生物標(biāo)志物，其可能作為潛在的評價(jià)指標(biāo)被應(yīng)用于未來抗抑郁藥物的研發(fā)。本研究采用慢性不可預(yù)知應(yīng)激制備抑郁大鼠模型，以路優(yōu)泰作為陽性對照藥物，以糖水消耗量、行為學(xué)指標(biāo)等評價(jià)模型建立成功與否及白金膠囊的抗抑郁藥效。在此基礎(chǔ)上，采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)采集正常大鼠、抑郁大鼠和白金膠囊治療大鼠腦組織樣本中的信息，SPSS和SIMACA-P軟件相結(jié)合對其進(jìn)行分析，以期尋找出和抑郁、白金膠囊相關(guān)的腦組織樣本中生物信息，探討白金膠囊治療抑郁癥的作用，為白金膠囊的進(jìn)一步研究提供參考。

1 資料和方法

1.1 一般資料 SD大鼠雄性大鼠40只［清潔級，（250±10）g］，許可證號：SCXK（京）2012-0001，購自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限技術(shù)公司。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由攝食飲水。1周后根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組和抑郁模型組，正常組10只，抑郁模型組30只。路優(yōu)泰（圣.約翰草提取物，批號：2500711，Dr.Willmar Schwabe GmbH＆Co.KG，Germany），白金膠囊（北京中醫(yī)藥大學(xué)倪健教授課題組自制，批號：201303），乙腈和甲酸（色譜級，F(xiàn)isher Scientific，NJ，USA），超純水（18.2 mΩ.cm）。Waters ACQUITY UPLC/Xevo G2 Q-TOF（Waters，USA）。

1.2 方法

1.2.1 抑郁大鼠的制備與分組 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用慢性不可預(yù)知應(yīng)激制備大鼠抑郁模型。除正常組外，應(yīng)激大鼠每天隨機(jī)接受不同的刺激并在造模過程中保持孤養(yǎng)狀態(tài)，共32 d。實(shí)驗(yàn)中采取的刺激方法見表1。

表1 慢性不可預(yù)知應(yīng)激制備大鼠抑郁模型工作表

造模結(jié)束后，對大鼠進(jìn)行體質(zhì)量的測定，糖水消耗量的測定以及曠場試驗(yàn)相關(guān)指標(biāo)的測定。數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。將已經(jīng)制備好的抑郁大鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分為2組，即抑郁模型組、路優(yōu)泰組、白金膠囊組。給藥組采用灌胃給藥的方式，分別給予白金膠囊0.389 5 g/d，路優(yōu)泰0.018 g/d連續(xù)28 d。1）糖水消耗實(shí)驗(yàn)：禁水12 h后同時(shí)放入飲用水和1%蔗糖水，2 h后用量筒讀取各只大鼠的飲用水量及蔗糖水消耗量，計(jì)算糖水消耗百分比。2）曠場試驗(yàn)：曠場試驗(yàn)在長、寬、高分別為90 cm、90 cm和45 cm的木制敞箱進(jìn)行。每只動(dòng)物測試1次，5 min/次。每只大鼠測試完畢以后用75%乙醇擦拭箱內(nèi)，確保無排泄物和氣味殘留對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。測試過程保持環(huán)境安靜，測試數(shù)據(jù)使用Ethovision軟件進(jìn)行分析。

1.2.2 樣本的處理 給藥結(jié)束后第2天同樣測定體質(zhì)量、糖水消耗量等指標(biāo)，測定完畢后次日處死大鼠，迅速分離全腦，稱重后按重量體積比1∶1加入冰甲醇溶液勻漿，-25℃冷凍備用。測定前樣本常溫解凍，加入等體積乙腈-水（3：1）溶液提取，渦旋1 min，離心取上清液，待測。

1.2.3 質(zhì)譜條件和液相條件 采用負(fù)離子檢測模式的ESI電離方式，質(zhì)量掃描范圍為50～1 400 M/Z。毛細(xì)管電壓：2 500 V；干燥氣流體積流量：700 L/H；干燥氣溫度：400℃。

色譜柱：Waters UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；流動(dòng)相：A（水-0.1%甲酸）和B（乙腈-0.1%甲酸）；柱溫：50℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；洗脫程序見表2。

表2 流動(dòng)相梯度變化表

2 結(jié)果

2.1 CUMS模型篩選結(jié)果 造模結(jié)束后，進(jìn)行大鼠體質(zhì)量、糖水消耗量和曠場實(shí)驗(yàn)的測定，其相關(guān)測定指標(biāo)結(jié)果見表3。從表的結(jié)果可以看到，模型組與正常大鼠比較，體質(zhì)量、糖水消耗量顯著下降。模型組大鼠平均體重為414 g，空白組為520 g；模型組糖水消耗量從空白組的34%下降至16%；曠場試驗(yàn)測得的中央格穿刺次數(shù)從空白組的5次下降為1次，平均運(yùn)動(dòng)速度和運(yùn)動(dòng)總距離降低約50%，說明采用慢性不可預(yù)知應(yīng)激制備抑郁模型成功。路優(yōu)泰治療的抑郁大鼠，體質(zhì)量無明顯變化，但糖水消耗量、中央格穿刺次數(shù)和平均運(yùn)動(dòng)速度、距離均向著空白組的方向有明顯恢復(fù)。經(jīng)白金膠囊治療的抑郁大鼠，平均體質(zhì)量回復(fù)至484 g，平均糖水消耗量增至24%，中央格穿刺次數(shù)增至3次，平均運(yùn)動(dòng)速度和運(yùn)動(dòng)距離回復(fù)至空白組的80%左右。體質(zhì)量和糖水消耗量的增長說明大鼠的食欲有所增加，抑郁帶來的興趣喪失有所好轉(zhuǎn)。綜上所述，白金膠囊能在一定程度上治療慢性不可預(yù)知應(yīng)激造成的抑郁癥。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對白金膠囊組、抑郁模型組和正常組大鼠大腦組織勻漿進(jìn)行代謝組學(xué)的研究。

2.2 代謝組學(xué)圖譜及數(shù)據(jù)解析 采用MZmine軟件提取質(zhì)譜峰并進(jìn)行反卷積處理去噪音、縫隙填補(bǔ)處理等，最終檢測到1 194個(gè)離子，其總離子流圖見圖1。在此基礎(chǔ)上對代謝圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)解析，PCA初步分析各組之間樣本的總體分布情況、自然聚集情況和奇異樣本的情況。最終得到的2個(gè)主要的部分：得分矩陣（白金膠囊組為紅色點(diǎn)，抑郁模型組為綠色，正常組為黑色。右邊是立體圖。該空間中每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本）和載荷矩陣（該空間中每一點(diǎn)代表一個(gè)指標(biāo)（ID：M/Z.RT）），如圖2所示。其中得分矩陣可以看出3組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但相對于正常組和抑郁模型組而言，白金膠囊組的樣本較分散，個(gè)體間差異明顯，其中白金膠囊組一只大鼠在樣本制備時(shí)出現(xiàn)操作失誤，將此數(shù)據(jù)剔除后E組的有效樣本量為9。

表3 抑郁指標(biāo)測定結(jié)果（n＝10）

圖1 大鼠腦組織典型總離子流

圖2 各組大鼠主成分分析得分圖（左）和載荷圖（右）

OPLS-DA作為有師監(jiān)督的方法，可以去除與分類無關(guān)的變量，使判斷集中在與類別相關(guān)的變量上，從而提高分類的準(zhǔn)確性，消除過擬合。分別對白金膠囊組E、抑郁模型組M和正常組N進(jìn)行兩兩比較，E vsM（R2＝0.988；Q2＝0.603），E vs N（R2＝0.994；Q2＝0.756），M vs N（R2＝0.996；Q2＝0.742），尋找差異候選物。結(jié)合以下4個(gè)數(shù)據(jù)庫以及相關(guān)的文獻(xiàn)，對化合物的結(jié)構(gòu)確認(rèn)，推測結(jié)構(gòu)化合物與該疾病的相關(guān)性。MASSBANK（http：//www.massbank.jp/index.html）METLIN（http：//metlin.scripps.edu/metabo＿search＿alt2.php）HMDB（http：//www.hmdb.ca/）KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/）

?；撬幔═aurine）、蘇糖酸（Threonic acid）、N-乙酰天冬氨酸（N-acetylaspartate）和神經(jīng)再損傷蛋白（Inosine）4個(gè)化合物被確證為潛在的抑郁生物標(biāo)記物，其質(zhì)譜相關(guān)信息見圖3，白金膠囊可以有效地使抑郁大鼠大腦中上述化合物濃度水平變化往正常組的方向回復(fù)。已有研究表明，Taurine水平在精神分裂癥患者血漿和腦脊液中有所下降，Taurine與神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)密切相關(guān)［6-9］，參與到神經(jīng)受體或配體的激活通路中，與5-HT、GABA等受體有緊密連接。N-acetylaspartate是天冬氨酸的衍生物，它是大腦除谷氨酸以外大腦中濃度最高的氨基酸，它參與腦液神經(jīng)元平衡滲透分子，還是脂質(zhì)和髓鞘合成原料，與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、磷脂神經(jīng)細(xì)胞軸突相關(guān)，是重要神經(jīng)元合成前體，還參與能量的合成和轉(zhuǎn)化；研究還表明，海綿狀腦白質(zhì)營養(yǎng)不良時(shí)腦中N-acetylaspartate的含量會(huì)顯著降低［10-11］。因此推測白金膠囊的抗抑郁藥效與其改變腦內(nèi)Taurine水平、作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)。此外，抑郁癥一個(gè)重要的表現(xiàn)是興趣喪失，自主活動(dòng)減少——能量降低。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果顯示，Threonic acid參與到能量代謝的全過程，直接影響到酮戊二酸的合成和檸檬酸循環(huán)的進(jìn)行，與氨基酸的代謝密切相關(guān)［12-13］。Inosine與ATP的轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，其研究始于1983年，研究還表明，Inosine水平與睡眠時(shí)間長短有關(guān)［14］。海綿狀腦白質(zhì)營養(yǎng)不良時(shí)腦中Inosine的含量也會(huì)顯著降低［11］。查詢KEGG的代謝通路圖，Inosine是以嘌呤代謝物的形式出現(xiàn)在腦部，它同樣參與到ADP、ATP的能量轉(zhuǎn)化過程。模型組中Threonic acid和Inosine的含量相對正常組降低，經(jīng)藥物治療后上升，即能量的變化過程，與二者的代謝過程相呼應(yīng)，推測白金膠囊治療抑郁的一個(gè)關(guān)鍵步驟為參與能量代謝的過程。

圖3 四種化合物相關(guān)信息一覽表

3 討論

大鼠和小鼠作為行為神經(jīng)學(xué)研究中最常用的動(dòng)物模型，它們能夠表現(xiàn)出與人類疾病相關(guān)的各種行為。在神經(jīng)行為研究的初期，大鼠是最常用的模式生物［15］。已有研究成功將CUMS用于抑郁大鼠動(dòng)物模型的制備，并被認(rèn)為是一種良好的疾病造模方法［16-17］。大鼠在許多標(biāo)準(zhǔn)的神經(jīng)藥理學(xué)任務(wù)中表現(xiàn)良好，而且它們的身體大小使我們更容易對其進(jìn)行侵入性操作。無論是代謝組學(xué)研究還是抗抑郁藥的藥效研究中，采用慢性不可預(yù)知應(yīng)激制備抑郁大鼠模型被普遍認(rèn)可和接受［18-19］。

基于代謝組學(xué)的思想，通過分析內(nèi)源性或外源性（藥物產(chǎn)生）代謝物組的變化，我們可以分析生物體的狀態(tài)，捕捉到和疾病相關(guān)的生物信號，推測生物體內(nèi)代謝通路的變化，為疾病的診斷或治療藥物的研發(fā)提供指導(dǎo)。已有科研人員將研究重點(diǎn)放在抑郁動(dòng)物模型的血漿或尿液樣本的整體代謝物研究上，主要的分析測定方法包括氣質(zhì)聯(lián)用色譜法、液質(zhì)聯(lián)用色譜法和磁共振成像［20-21］；還有一部分研究著眼于研究抗抑郁藥物在血漿或尿液樣本中的代謝情況［22-23］；作為一種重要的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，抑郁與大腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)密切相關(guān)，因此研究選取大鼠的腦組織作為代謝組學(xué)的研究對象。本研究希望以白金膠囊作為中藥復(fù)方抗抑郁藥物的代表，從系統(tǒng)生物學(xué)的研究角度出發(fā)，結(jié)合代謝組學(xué)的研究技術(shù)，為抗抑郁中藥的研究提供新的思路。

［1］Harutyunyan，M.The inflammatory biomarker YKL-40 as a new prognostic marker for all-causemortality in patients with heart failure［J］. Immunobiology，2012，217（6）：652-656.

［2］Saenz，A.J.Measurement of a plasma stroke biomarker paneland cardiac troponin T in marathon runners before and after the 2005 Boston marathon［J］.Am JClin Pathol，2006，126（2）：185-189.

［3］Buettner，R.and C.Heydt.Biomarker analysis from a pathologist's view. Founding the rationale for personalised treatment of lung cancer［J］. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz，2013，56（11）：1502-1508.

［4］Kondo，T.Inconvenient truth：Cancer biomarker development by using proteomics［J］.Biochim Biophys Acta，2014，1844（5）：861-865.

［5］Zheng，P.Peripheral metabolic abnormalities of lipids and amino acids implicated in increased risk of suicidal behavior in major depressive disorder［J］.Metabolomics，2012，9（3）：688-696.

［6］Gonzalez-Quevedo，A.Amino acids as biochemicalmarkers in epidemic and endemic optic neuropathies［J］.Rev Cubana Med Trop，1998，50（s）：241-244.

［7］Sturman，J.A.Tissue taurine content，activity of taurine synthesis enzymes and conjugated bile acid composition of taurine-deprived and taurine-supplemented rhesusmonkey infants at6 and 12 mo of age［J］.J Nutr，1991，121（6）：854-862.

［8］Gonzalez-Quevedo，A.Amino acid levels and ratios in serum and cerebrospinal fluid of patientswith optic neuropathy in Cuba［J］.Nutr Neurosci，2001，4（1）：51-62.

［9］Do，K.Q.Gamma-Glutamylglutamine and taurine concentrations are decreased in the cerebrospinal fluid of drug-naive patients with schizophrenic disorders［J］.JNeurochem，1995，65（6）：2652-2662.

［10］Rothstein，J.D.Abnormal excitatory amino acidmetabolism in amyotrophic lateral sclerosis［J］.Ann Neurol，1990，28（1）：18-25.

［11］Tavazzi，B.Simultaneous high performance liquid chromatographic separation of purines，pyrimidines，N-acetylated amino acids，and dicarboxylic acids for the chemical diagnosisof inborn errors ofmetabolism［J］. Clin Biochem，2005，38（11）：997-1008.

［12］Harding，J.J.Sugars including erythronic and threonic acids in human aqueous humour［J］.Curr Eye Res，1999，19（2）：131-136.

［13］Guneral，F(xiàn).and C.Bachmann，Age-related reference values forurinary organic acids in a healthy Turkish pediatric population［J］.Clin Chem，1994，40（6）：862-866.

［14］Harkness，R.A.and R.J.Lund，Cerebrospinal fluid concentrations of hypoxanthine，xanthine，uridine and inosine：high concentrations of the ATPmetabolite，hypoxanthine，afterhypoxia［J］.JClin Pathol，1983，36（1）：1-8.

［15］Crawley，J.N.Behavioral phenotyping of rodents［J］.Comp Med，2003，53（2）：140-146.

［16］Zhang，Y.Chronic antidepressant administration alleviates frontal and hippocampal BDNF deficits in CUMS rat［J］.Brain Res，2010，1366：141-148.

［17］Ossowska，G.Antidepressants in chronic unpredictable mild stress（CUMS）-induced deficit of fighting behavior［J］.Pol JPharmacol，2004，56（3）：305-311.

［18］Liu，X.J.Urinary metabonomic study using a CUMS ratmodel of depression［J］.Magn Reson Chem，2012，50（3）：187-192.

［19］Pan，Y.Impaired hypothalamic insulin signaling in CUMS rats：restored by icariin and fluoxetine through inhibiting CRF system［J］.Psychoneuroendocrinology，2013，38（1）：122-134.

［20］Jia，H.M.Integration of（1）H NMR and UPLC-Q-TOF/MS for a comprehensive urinarymetabonomics study on a ratmodel of depression induced by chronic unpredictable mild stress［J］.PLoS One，2013，8（5）：e63624.

［21］Zhang，F(xiàn).Metabonomics study of urine and plasma in depression and excess fatigue rats by ultra fast liquid chromatography coupled with ion trap-time of flightmass spectrometry［J］.Mol Biosyst，2010，6（5）：852-861.

［22］Wang，X.Metabonomics approach to assessing themodulatory effects of St John's wort，ginsenosides，and clomipramine in experimental depression［J］.JProteome Res，2012，11（12）：6223-6230.

［23］Su，Z.H.Urinary metabonomics study of anti-depressive effect of Chaihu-Shu-Gan-San on an experimentalmodel of depression induced by chronic variable stress in rats［J］.J Pharm Biomed Anal，2011，55（3）：533-539.

（2014-05-05收稿 責(zé)任編輯：王明）

Study on Anti-dep ression of Baijin Capsule based on M etabolom ics

Yang Pei，Li Xuechun，Lin Longfei，Tian Jingchen，Ni Jian
（School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Objective：To explore themechanism of Baijin capsule in the treatment of depression based onmetabolomics.Methods：SD ratsmodeled by Chronic Unpredictable Mild Stressweremade as experimental objects.The effect ofmodeling and antidepressant efficacy of Baijin capsule was appraised before the study of brain metabolomics with the results of determination including the body weight，sucrose consumption and open field trial.Additionally，the study attempted to find out the biological information related to depression in samples of brain tissue based on brainmetabolomics research.Pharmacokinetics research wasobtained by the combined resultof LC-MS/MS and analytical software SPSS/SIMACA-P and retrieval of database（MASSBANK，METLIN，HMDB and KEGG）and literature analysis.Results：One thousand one hundred and ninty four compoundswere determ ined by Metabolom ics.The results of PCA and OPLS-DA indicated that the scorematrix in normal group，CUMSgroup and drug group were distributed in three different areas whichmeant that therewas a difference between groups.Fourmain indicators of compound taurine，threonic acid，N-acetylaspartateand inosinewere identified by integrating load matrix，library search and literature analysis.Conclusion：Baijin capsule is able to regulate the brain as an antidepressant by adjusting the levels of amino acids，effecting on central nervous system of neurotransmitter and energymetabolism.

Metabolomics；LC-MS/MS；Depression

R277.7

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.10.026

科技重大專項(xiàng)課題-白金膠囊治療精神性疾病—抑郁癥的研究與開發(fā)（編號：2012ZX09103201-026）

倪健，教授，現(xiàn)任北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院副院長，主要研究方向：藥物新劑型、新技術(shù)及其體內(nèi)過程，Tel：（010）84738607，E-mail：njtcm＠263.net