李勞冬 莫碧文△ 于會娜 王昌明 曾錦榮 王績英 李黨育

纖維支氣管鏡活檢組織Sox2基因對肺癌的診斷價值*

李勞冬1莫碧文1△于會娜2王昌明1曾錦榮1王績英1李黨育3

目的 探討纖維支氣管鏡活檢組織標本中干細胞標志物Sox2 mRNA對肺癌的診斷價值。方法采用RT-PCR技術檢測100例肺癌患者和18例良性肺疾病患者纖維支氣管鏡活檢標本中Sox2 mRNA的表達，隨后利用免疫組化技術驗證Sox2蛋白在50例肺癌組織、32例良性病變肺組織和18例癌旁正常肺組織間表達的差異，分析Sox2 mRNA表達與肺癌臨床病理參數的關系及其在肺癌診斷中的潛在價值。結果Sox2 mRNA和蛋白在肺癌組織中的表達量顯著高于非癌肺組織（P＜0.05）。肺癌患者不同年齡、性別、病理類型、TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結是否轉移，Sox2 mRNA的表達差異無統計學意義。Sox2 mRNA ROC曲線下面積為0.748，臨界值取0.513時，其靈敏度和特異度分別為85.0%和61.1%。結論纖維支氣管鏡活檢組織標本Sox2 mRNA可能是肺癌診斷的有效標志物。

肺腫瘤；支氣管鏡檢查；腫瘤干細胞；腫瘤標記，生物學；免疫組織化學；Sox2基因

Sox2是性別決定區(qū)Y框架蛋白(SRY-related HMG-box genes,Sox)家族中的重要一員，是胚胎干細胞維持其多潛能性的重要轉錄因子，在胚胎發(fā)育的各階段中都起著關鍵性作用。研究表明，Sox2不僅在胚胎干細胞中表達，在乳腺癌、膠質母細胞瘤、胰腺癌、食管癌、肺癌等人類原發(fā)性腫瘤中也高表達，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤和轉移關系密切，是潛在的腫瘤診斷標志物、治療靶點和預后標志物[1]。纖維支氣管鏡檢查是目前臨床診斷肺癌的常規(guī)方法。然而，纖維支氣管鏡活檢組織中的Sox2 mRNA在肺癌中的診斷價值，及Sox2 mRNA的檢測可否輔助纖維支氣管鏡檢查目前國內外尚少見報道。本研究通過檢測Sox2 mRNA和Sox2蛋白在肺癌和良性肺病變組織中的表達差異，探討纖維支氣管鏡活檢組織Sox2 mRNA在肺癌診斷中的價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2011年1月—2012年1月桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院和附屬南溪山醫(yī)院臨床病理資料完整的肺癌患者纖維支氣管鏡活檢標本100例。其中90例經纖維支氣管鏡活檢病理確診為肺癌，另10例纖維支氣管鏡活檢標本并未見癌細胞，但經肺穿刺、手術切除或纖維支氣管鏡刷片病理確診為肺癌。其中男84例，女16例，年齡29～80歲，平均（59.0±10.5）歲。非小細胞肺癌66例，其中鱗癌50例，腺癌16例；小細胞肺癌24例；其他類型肺癌10例。根據2009年UICC肺癌TNM分期標準，Ⅰ期7例，Ⅱ期6例，Ⅲ期60例，Ⅳ期27例，其中85例有淋巴結轉移，15例無淋巴結轉移。收集同期良性肺疾病患者纖維支氣管鏡活檢標本18例，均無腫瘤證據，肺泡灌洗找到抗酸桿菌，經抗感染（或抗結核）及對癥治療后臨床癥狀消失，胸片或肺部CT示病灶明顯吸收而確診為良性病變。其中支氣管炎7例，肺結核6例，肺炎3例，支氣管內膜結核1例，支氣管擴張1例。男14例，女4例，年齡23～73歲，平均（56.9±12.4）歲。2組間性別（χ2=0.094）、年齡（t=0.749）比較差異無統計學意義（P＞0.05）。另收集桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院2002年1月—2012年12月病史資料完整的肺癌手術切除石蠟標本50例，癌旁正常肺組織18例和良性病變肺組織32例行免疫組化檢測。肺癌組織中男38例，女12例；年齡34～76歲，平均（55.0±8.8）歲。小細胞肺癌7例，非小細胞肺癌43例，其中鱗癌23例，腺癌17例，支氣管肺泡細胞癌3例。癌旁正常肺組織中男12例，女6例；年齡48～73歲，平均（56.7±6.4）歲。良性病變肺組織中男23例，女9例；年齡23～72歲，平均（51.5±11.4）歲。3組間性別（χ2=0.734）、年齡（F=2.352）比較差異無統計學意義（P＞0.05）。所有患者術前均未行放、化療，且術前均經纖維支氣管鏡活檢。本研究通過桂林醫(yī)學院倫理委員會審核，術前均告知患者本檢查的目的和取材方式，獲得患者的同意并簽知情同意書。

1.2 主要試劑 Sox2（319 bp）引物：上游5′-GCT AGT CTC CAA GCG ACG AA-3′和下游5′-TAC AGT CTA AAA CTT TTG CCC TT-3′；內參β-actin（417 bp）引物：上游5′-ACA GAG CCT CGC CTT TGC CGATC-3′，下游5′-TGG GTC ATC TTC TCG CGG TTG G-3′；均由上海invitrogen公司合成。Trizol總RNA抽提試劑盒和逆轉錄試劑盒均購自TaKaRa公司。免疫組化試劑盒和DAB顯色劑購自北京中杉金橋，鼠抗人Sox2單克隆抗體購自美國ProMab生物技術公司。

1.3 方法

1.3.1 RT-PCR檢測Sox2 mRNA的表達 活檢組織用DEPC水沖洗，置凍存管，立即放入液氮罐冷凍，再移至-80℃冰箱保存待用。取出纖維支氣管鏡活檢凍存標本，在超凈工作臺內，嚴格按照Trizol說明書提取RNA；按照逆轉錄酶使用說明將樣本mRNA逆轉錄成cDNA，隨后進入PCR擴增；反應體系（25 μL）：cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，2×Mix 12.5 μL，加入RNase-free水至25 μL。反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56.2℃退火30 s（β-actin退火溫度為60.2℃），72℃延伸45 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸2 min。配1.5%～2%瓊脂糖凝膠，取目的基因PCR產物6 μL和內參PCR產物6 μL混勻后跑電泳，用JS-780凝膠成像系統對條帶進行灰度分析，將每個標本內參設為1，以Sox2 mRNA條帶灰度值與其內參（β-actin）條帶灰度值之比作為每例標本Sox2 mRNA的表達量。

1.3.2 免疫組化檢測Sox2蛋白的表達 免疫組化染色嚴格按照PV-9000二步法免疫組化試劑盒說明操作?？乖迯筒捎脵幟仕猁}緩沖液（0.01 mol/L pH6.0）高溫高壓修復，一抗稀釋濃度為1∶800。每批實驗均采用已知Sox2陽性的肺鱗癌組織切片為陽性對照，以PBS代替一抗為陰性對照。結果判斷：鏡下隨機讀取10個不重疊的高倍（400倍）視野，大約1 000個細胞被觀察分析。Sox2蛋白的表達依據陽性細胞率及陽性強度綜合計算其表達量。陽性率評分標準：陰性，0分；1%～30%陽性細胞，1分；31%～60%陽性細胞，2分；60%以上陽性細胞，3分。陽性強度評分標準：陰性，0分；淡黃色，1分；黃色或棕褐色，2分；深棕色，3分。陽性表達水平得分=陽性比例得分×陽性強度得分，0分為陰性（-），1～2分為弱陽性（+），3～6分為中度陽性（++），7～9分為強陽性表達（+++）。所有切片均由一位病理科醫(yī)師和一位訓練良好的研究者在不了解患者臨床資料的情況下獨立觀察判斷，對獨立判斷不一致的病例再共同進行觀察判定。

1.4 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件包進行統計學處理。正態(tài)分布計量資料以s表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。不符合正態(tài)分布或方差不齊時以M(P25,P75)表示，采用非參數Mann-Whitney U檢驗或Kruskal-Wallis H檢驗。計數資料以例（%）表示，行χ2檢驗。通過ROC曲線來評價Sox2 mRNA在肺癌中的診斷價值。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Sox2 mRNA的表達 Sox2 mRNA在肺癌纖維支氣管鏡活檢組織中的陽性率為98%(98/100)，在良性肺病變的陽性率為83.3%(15/18)，差異有統計學意義（χ2=4.876，P＜0.05）。纖維支氣管鏡活檢肺癌組織Sox2 mRNA的灰度值為1.450(0.859,2.479)，良性肺病變組織為0.385(0.006,1.172)，差異有統計學意義（U=454.5，P=0.001）。

2.2 Sox2 mRNA的表達與肺癌臨床病理參數的關系 肺癌患者不同年齡、性別、病理類型、TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結是否轉移，Sox2 mRNA的表達差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.3 Sox2 mRNA在肺癌中的診斷價值 采用ROC曲線評價Sox2 mRNA對肺癌的診斷價值，Sox2 mRNA曲線下的面積為0.748，見圖1。臨界值取0.513時，其靈敏度和特異度分別為85.0%和61.1%。10例纖維支氣管鏡活檢病理檢查未見癌細胞的肺癌患者，其纖維支氣管鏡活檢標本Sox2 mRNA灰度值均大于0.513。

2.4 Sox2蛋白的表達 Sox2陽性蛋白顆粒主要定位于胞核，在所有正常肺組織和良性病變肺組織的支氣管上皮、鱗狀化生上皮均呈陽性表達，在肺泡上皮呈陰性表達。Sox2在肺癌中的表達水平顯著高于正常肺組織（U=207.0）和良性病變肺組織（U=426.5），差異有統計學意義（P＜0.01），見表2、圖2。

3 討論

隨著環(huán)境污染加重和人口老齡化程度加重，肺癌的發(fā)病率在我國呈不斷上升趨勢。盡管近幾十年來肺癌患者的預后有所改善，但其5年生存率只有16%[2]。早期診斷、早期手術切除是提高肺癌患者生存率的關鍵。纖維支氣管鏡檢查是肺癌診斷的常用檢查方法，包括纖維支氣管鏡鉗取活檢、纖維支氣管鏡細胞刷片和肺泡灌洗等。即使常規(guī)的纖維支氣管鏡檢查聯合運用，其診斷肺癌的敏感度也只有90%[3]。近來，Maldonado等[4]認為，通過先進的分子技術可輔助常規(guī)的纖維支氣管鏡標本病理診斷，從而篩查和早期診斷肺癌。

Sox2是胚胎干細胞維持其多潛能性的重要轉錄因子，在維持食管、支氣管的正常發(fā)育及神經干細胞、肺支氣管基底細胞的干細胞特性方面發(fā)揮著重要作用，是重要的干細胞標志物。Sanada等[5]研究發(fā)現，Sox2在胰腺導管內瘤變、原位癌和浸潤性導管癌中的表達呈逐漸增加的趨勢，且其高表達在低分化胰腺癌和血管浸潤性胰腺癌中更明顯，提示Sox2可能參與了胰腺癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤和轉移。最近，有報道稱Sox2在胃癌中的陽性表達與胃癌的浸潤深度、淋巴結轉移顯著相關，是判斷胃癌患者預后不佳的標志物[6]。另有研究發(fā)現，沉默Sox2可顯著抑制膠質腦細胞瘤的細胞克隆增殖能力和體內成瘤能力，Sox2是治療膠質腦細胞瘤有效的作用靶點[7]。Lu等[8]觀察到Sox2在人類原發(fā)性肺鱗癌和部分肺腺癌中高表達，Sox2的高表達可誘導遠端氣道產生近端氣道樣化生并引起腫瘤，Sox2的高表達參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展。Chapman等[9]則發(fā)現，檢測血液標本中的Sox2自身抗體是診斷小細胞肺癌的有效指標，有助于對小細胞肺癌高危人群進行早期診斷。

本研究顯示Sox2 mRNA和蛋白在肺癌中的表達顯著高于非癌肺組織，提示Sox2基因在肺癌組織中表達上調，可能在肺癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。利用免疫組化技術，筆者觀察到Sox2蛋白在非癌肺組織中主要表達于支氣管上皮細胞和鱗狀化生支氣管上皮細胞，與以往研究結果相符[8,10]。這些Sox2陽性的支氣管上皮細胞可能通過惡性突變參與了肺癌的發(fā)生、發(fā)展。一般認為，Sox2在肺癌中的表達與組織類型有關，Sox2在肺鱗癌中的表達顯著高于肺腺癌。本研究發(fā)現，不同年齡、性別、病理類型、TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結是否轉移肺癌患者，Sox2 mRNA的表達差異無統計學意義。這可能與纖維支氣管鏡活檢標本的異質性有關，由于纖維支氣管鏡活檢標本體積小，癌細胞比例低及標本中包含或多或少的支氣管上皮細胞和鱗狀化生上皮細胞，從而干擾了Sox2 mRNA在肺癌患者纖維支氣管鏡活檢組織中的表達與肺癌的臨床病理參數的關系。筆者發(fā)現ROC曲線下的面積為0.748，提示其在肺癌中具有較高的診斷價值。此外，本研究10例纖維支氣管鏡活檢病理檢查假陰性的肺癌患者，其纖維支氣管鏡活檢標本Sox2 mRNA灰度值均大于0.513。提示此種情況，即使纖維支氣管鏡活檢常規(guī)病理檢查未見癌細胞，仍高度懷疑為肺癌，必要時需行肺穿刺活檢或手術切除肺活檢明確診斷。檢測纖維支氣管鏡活檢組織標本Sox2 mRNA的表達或許可輔助常規(guī)纖維支氣管鏡檢查。而可否通過檢測纖維支氣管鏡細胞刷片或肺泡灌洗液或血液標本中Sox2 mRNA的表達來篩查和早期診斷肺癌需進一步研究予證實。

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（2013-06-19收稿 2013-10-27修回）

（本文編輯 魏杰）

The Diagnostic Value of Sox2 mRNA Transcription Level in Bronchoscopy Biopsy Specimens in Lung Cancer

LI Laodong1,MO Biwen1,YU Huina2,WANG Changming1,ZENG Jinrong1,WANG Jiying1,LI Dangyu3
1 Department of Respiratory Medicine,Hospital Affiliated Guilin Medical College,Guilin 541001,China;2 Department of Pediatrics,Jingzhou Central Hospital of Hubei Province;3 Department of Respiratory Medicine,Nan Xi Shan Hospital

ObjectiveTo study the diagnostic value of Sox2 mRNA transcription level in bronchoscopic biopsy specimens from lung cancer patients.MethodsThe expression of Sox2 mRNA was detected using RT-PCR from 100 human lung cancer biopsy and 18 non-cancer lung biopsy through bronchoscopy.The expression of Sox2 protein was examined by immunohistochemistry from 50 cases of lung cancer biopsy,32 cases of benign lung lesions and 18 cases of pericarcinomatous normal lung tissues.Then the relationships between Sox2 mRNA transcription level and lung cancer clinical pathological parameters were analyzed to test the diagnostic value of Sox2 transcription level.ResultsThe transcription of Sox2 mRNA and its protein expression level were significantly higher in lung cancer than that in benign pulmonary disease tissues（P＜0.05）.The transcription of Sox2 mRNA was not correlated with age,gender,histology,lymph node metastasis,TNM stage and differentiation of lung cancer patients(P＞0.05).The Sox2 mRNA yielded an area of 0.748 under the ROC curve with the sensitivity of 85.0%and the specificity of 61.1%,taking the cut-off value of 0.513.ConclusionThe Sox2 mRNA might be a useful diagnostic marker for lung cancer.

lung neoplasm;bronchoscopy;neoplastic stem cells;tumor markers,biological;immunohistochemistry; Sox2 gene

R734.2

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.04.004

*廣西衛(wèi)生廳重點科研項目（項目編號：重2012003，重2011008，重2010046）

1桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸內科（郵編541001）；2荊州市中心醫(yī)院兒科；3南溪山醫(yī)院呼吸內科

△通訊作者 E-mail:mobiwen2002@sohu.com