卜國云 杜區(qū)成 吳葉 鄧樹才 朱加亮 商衛(wèi)林

脊髓缺血再灌注損傷后 μ-Calpain mRNA 及蛋白的表達(dá)

卜國云 杜區(qū)成 吳葉 鄧樹才 朱加亮 商衛(wèi)林

目的探討鈣調(diào)蛋白 μ-Calpain 在脊髓缺血再灌注損傷中的表達(dá)及意義。方法建立成年SD 大鼠缺血再灌注損傷模型，利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)及 Western-blot 技術(shù)檢測(cè)模型建立后 2 h、6 h、12 h、24 h、48 h 及 72 h μ-Calpain mRNA 及蛋白的表達(dá)情況。利用 Western-blot 技術(shù)檢測(cè) μ-Calpain 特異性底物 α-II Spectrin 的降解，并與對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果與對(duì)照組相比，脊髓缺血再灌注損傷模型建立后 2 h，損傷段脊髓 μ-Calpain mRNA 的表達(dá)開始增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，12 h 后明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0.05 )，48 h 達(dá)峰值 ( P＜0.001 )，72 h 后仍有 μ-Calpain mRNA 的表達(dá)且高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0.05 )。模型建立后 2 h 損傷段脊髓 μ-Calpain 蛋白增高，48 h 達(dá)峰值 ( P＜0.001 )，72 h 后 μ-Calpain 蛋白仍高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＜0.05 )。α-II Spectrin 降解在模型建立后 2 h 即出現(xiàn)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＞0.05 )，72 h 后有少量 α-II Spectrin 殘留。結(jié)論脊髓缺血再灌注損傷模型建立后，μ-Calpain mRNA 及蛋白表達(dá)增加，對(duì)其特異性底物 α-II Specrin 進(jìn)行降解，參與了脊髓缺血再灌注損傷的病理過程。

卡配因；縮蛋白；再灌注損傷；脊髓損傷

在原發(fā)性脊髓損傷后，一系列繼發(fā)性病理改變 導(dǎo)致神經(jīng)功能的進(jìn)一步喪失[1]。繼發(fā)性損傷的機(jī)制包括脊髓缺血、細(xì)胞膜氧化、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)外離子失衡、細(xì)胞內(nèi)蛋白酶系統(tǒng)的病理性激活、細(xì)胞骨架破壞等[2]。Calpain 蛋白是廣泛存在于生物體內(nèi)的蛋白酶，被 Ca2+激活后分解細(xì)胞骨架。本研究利用大鼠脊髓缺血性損傷模型，研究脊髓在缺血性損傷后 Calpain 蛋白不同時(shí)間段的表達(dá)情況。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

成年雄性 SD 大鼠 70 只，體重 250～300 g，隨機(jī)分為對(duì)照組和脊髓缺血后 2 h、6 h、12 h、24 h、48 h 及 72 h 組，每組 10 只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供。

二、主要試劑

Trizol 試劑，美國 Invitrogen 公司；SuperScript First-Strand Synthesis 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國 Invitrogen公司；RealMasterMix SYBR Green 試劑盒，天根公司；兔抗鼠 μ-Calpain 抗體 ( Santa Cruz，美國 )；兔抗鼠 α-II Spectrin 抗體 ( Santa Cruz，美國 )。羊抗兔 IgG ( 北京中杉金橋 )；ECL 試劑盒 ( Amersham Pharmacia，美國 )。

三、損傷模型制作及取材

速眠新按 0.02 ml / 20 g 腹腔注射進(jìn)行麻醉，采用 Zivin 法制作動(dòng)物模型。手術(shù)在無菌條件下操作。動(dòng)物先俯臥固定于手術(shù)臺(tái)上，消毒后經(jīng)后正中入路切除 L2～4椎板，暴露 L3～4節(jié)段硬脊膜；關(guān)閉切口后，置動(dòng)物于仰臥位，經(jīng)腹正中入路暴露腹主動(dòng)脈，于左腎動(dòng)脈起始部遠(yuǎn)端以動(dòng)脈夾夾閉腹主動(dòng)脈40 min。對(duì)照組僅暴露至左腎動(dòng)脈起始部遠(yuǎn)端。實(shí)驗(yàn)組按不同時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物，對(duì)照組在術(shù)后 2 h 處死。取出損傷段脊髓，0 ℃ 生理鹽水沖洗后液氮中保存。

四、總 RNA 及總蛋白的提取

采用 Trizol 法提取總 RNA 及總蛋白，操作步驟嚴(yán)格按 Trizol 說明書進(jìn)行。所得 RNA 經(jīng) 10 g / L 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可見 5 S、18 S 及 28 S 三條帶，未見RNA 降解帶及 DNA 污染帶。Trizol 提取 RNA 后，保留有機(jī)相，沉淀 DNA 后取上清液提取蛋白質(zhì)，以牛血清蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用 Bradford 法用紫外可見分光光度儀測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度至 10 μg / μl。

五、cDNA 合成及實(shí)時(shí)熒光定量 PCR

使用 SuperScript First-Strand Synthesis 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，具體步驟按試劑盒說明書操作。所得cDNA 在 -20 ℃ 條件下保存。以 β-actin 為內(nèi)參，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR。μ-Calpain 上游引物為 5’-CTG TCA AAC CCC C CAG TTC AT-3’，下游引物為5’-GCA GCC AAG AGC CAA CAG T-3’，產(chǎn)物片段 213 bp。β-actin 上游引物為 5’-CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC-3’；下游引物為 5’-TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3’，產(chǎn)物片段 150 bp。按 RealMasterMix SYBR Green 試劑盒說明書進(jìn)行操作，反應(yīng)條件如下：94 ℃ 預(yù)變性 2 min；94 ℃ 變性20 s；56 ℃ 退火 30 s；60 ℃ 延伸 40 s，40 個(gè)循環(huán)。μ-Calpain 的表達(dá)值相對(duì)于 β-actin 表達(dá)水平計(jì)算 ( 相對(duì)定量法：Ratio＝2-△△CT)。

六、Western-blot 檢測(cè) μ-Calpain 及其底物 α-II Spectrin

取總蛋白樣本 5 μl，加入 2×SDS-PAGE 上樣緩沖液，加熱至 100 ℃ 使蛋白充分變性，進(jìn)行電泳將蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上。取出 PVDF 膜后，洗去轉(zhuǎn)膜液，加入 Western 封閉液，在搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫封閉 2 h，加入 μ-Calpain 一抗 ( 1∶500 )，4 ℃緩慢搖動(dòng)孵育過夜。加入 μ-Calpain 二抗 ( 1∶5000 )及 β-actin 抗體 ( 1∶10000 )，在 ECL kit 中顯色，膠片曝光、顯影。同法對(duì) α-II Spectrin 進(jìn)行 Westernblot 分析。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用 t 檢驗(yàn)進(jìn)行對(duì)照組與各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、脊髓缺血再灌注損傷后 μ-Calpain mRNA 的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組術(shù)后 μ-Calpain mRNA 的表達(dá)隨時(shí)間的推移而升高，2～6 h μ-Calpain mRNA 與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＞0.05 )，12 h 開始增高，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＜0.05 )，48 h 達(dá)峰值，48～72 h 下降，但仍高于對(duì)照組 ( 圖1，表1 )。

圖1 對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組 μ-Calpain mRNA 的相對(duì)表達(dá)Fig.1 The relative expressions of μ-Calpain mRNA in the control and experimental groups

表1 對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組 μ-Calpain mRNA 的相對(duì)表達(dá) (±s )Tab.1 The expressions of μ-Calpain mRNA in the control and experimental groups (±s )

表1 對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組 μ-Calpain mRNA 的相對(duì)表達(dá) (±s )Tab.1 The expressions of μ-Calpain mRNA in the control and experimental groups (±s )

注：a與對(duì)照組相比，P ＜ 0.05Notice:aMeant when compared with that of the control group, P＜0.05

分組 n μ-Calpain mRNA ( 對(duì)數(shù)值 )對(duì)照組 10 0.72±0.099 2 h 組 10 0.73±0.087 6 h 組 10 0.79±0.070 12 h 組 10 1.01±0.099a24 h 組 10 1.10±0.077a48 h 組 10 1.38±0.091a72 h 組 10 1.21±0.069a

二、Western-blot 結(jié)果

與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組 μ-Calpain 蛋白在術(shù)后6 h 開始增高，48 h 達(dá)峰值，72 h 下降，但仍高于對(duì)照組 ( P＜0.05 ) ( 圖2，表2 )；α-II Spectrin 在造模成功后 2 h 就開始降解，但與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＞0.05 )，6～72 h α-II Spectrin 蛋白顯著降低 ( 圖3，表3 )。Western-blot 電泳結(jié)果 ( 圖4 )。

圖2 對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組 μ-Calpain 蛋白的相對(duì)表達(dá)Fig.2 The relative expressions of μ-Calpain protein in the control and experimental groups

表2 對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組 μ-Calpain 蛋白的相對(duì)表達(dá) (±s )Tab.2 The relative expressions of μ-Calpain protein in the control and experimental groups (±s )

表2 對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組 μ-Calpain 蛋白的相對(duì)表達(dá) (±s )Tab.2 The relative expressions of μ-Calpain protein in the control and experimental groups (±s )

注：a與對(duì)照組相比，P ＜ 0.05Notice:aMeant when compared with that of the control group, P＜0.05

分組 n μ-Calpain 蛋白 ( 相對(duì)值 )對(duì)照組 10 0.47±0.031 2 h 組 10 0.47±0.061 6 h 組 10 0.67±0.083a12 h 組 10 0.82±0.091a24 h 組 10 0.89±0.078a48 h 組 10 1.54±0.070a72 h 組 10 1.25±0.054a

表3 對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組 α-II Spectrin 的相對(duì)表達(dá) (±s )Tab.3 The relative expressions of α-II spectrin in the control and experimental groups (±s )

表3 對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組 α-II Spectrin 的相對(duì)表達(dá) (±s )Tab.3 The relative expressions of α-II spectrin in the control and experimental groups (±s )

注：a與對(duì)照組相比，P ＜ 0.05Notice:aMeant when compared with that of the control group, P＜0.05

分組 n α-II Spectrin ( 相對(duì)值 )對(duì)照組 10 15.24±0.788 2 h 組 10 14.59±1.054 6 h 組 10 12.55±0.707a12 h 組 10 10.44±0.691a24 h 組 10 9.10±1.033a48 h 組 10 6.06±0.403a72 h 組 10 5.08±1.100a

圖4 對(duì)照組及造模后各時(shí)間點(diǎn)蛋白條帶Fig.4 The protein band at different time points after the model was established in the control group

討 論

脊髓損傷包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，原發(fā)性損傷決定了脊髓損傷的程度，而繼發(fā)性損傷可以引起脊髓結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)一步破壞，限制了脊髓功能的恢復(fù)，脊髓的出血和缺血再灌注損傷是繼發(fā)性損傷中的重要機(jī)制[3]。本研究中，筆者利用脊髓的缺血再灌注損傷模型對(duì)脊髓損傷后 μ-Calpain mRNA、蛋白及其底物 α-II Spectrin 進(jìn)行研究。

脊髓損傷后導(dǎo)致?lián)p傷平面以下的感覺和運(yùn)動(dòng)缺失。脊髓損傷后的病理變化復(fù)雜，有多種生物化學(xué)機(jī)制參與了細(xì)胞和軸突的破壞。細(xì)胞內(nèi) Ca2+超負(fù)荷被認(rèn)為是缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一。Ca2+超負(fù)荷可導(dǎo)致線粒體功能破壞、各種鈣依賴蛋白酶和脂肪酶的激活。Calpain 蛋白是一種 Ca2+依賴性蛋白酶，屬于半胱氨酸蛋白酶家族，廣泛地存在于哺乳動(dòng)物的多種組織中，參與多種病理生理過程。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Calpain 以前蛋白酶的形式存在于靜止細(xì)胞中，對(duì)正常細(xì)胞的細(xì)胞骨架、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝有調(diào)節(jié)作用[4]。Calpain 主要分為兩個(gè)亞型，即μ-Calpain 和 m-Calpain，受不同濃度的 Ca2+激活。Calpain 蛋白受 Ca2+激活后，可以降解細(xì)胞骨架蛋白、膜蛋白，并與細(xì)胞凋亡有關(guān)。

在脊髓重物撞擊損傷模型中，Ray 等[5]發(fā)現(xiàn)損傷段脊髓內(nèi) μ-Calpain mRNA 在傷后的 72 h 內(nèi)都沒有明顯增高，而 μ-Calpain 蛋白的活性在傷后的 4 h開始增強(qiáng)，在 48 h 達(dá)到峰值，但是該作者在另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，μ-Calpain mRNA 和蛋白在造模后的24 h 同時(shí)達(dá)到最大值[6]。而張子峰等[7]利用免疫組化技術(shù)對(duì)大鼠的脊髓缺血再灌注損傷模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，μ-Calpain 蛋白在造模后的 72 h 表達(dá)最多，在7 天后仍有表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在造模后的最初 6 h 內(nèi)，μ-Calpain mRNA 并沒有顯著增加，而造模后的 72 h 內(nèi)都保持了非常高的水平；μ-Calpain 蛋白的表達(dá)在傷后早期就有了明顯的增高。造成本實(shí)驗(yàn)與其它實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異可能有以下兩項(xiàng)原因：( 1 )年齡是影響脊髓損傷后 Calpain 蛋白表達(dá)的重要因素之一，Wingrave 等[8]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)青年鼠比成年鼠在脊髓損傷后 Calpain 蛋白的表達(dá)要低，本實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物體重偏大，在 250～300 g，而其它幾項(xiàng)實(shí)驗(yàn)所采用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重在 200 g 左右，這一點(diǎn)可能會(huì)造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異；( 2 ) 脊髓損傷的撞擊模型除了能導(dǎo)致脊髓的短暫缺血外，能造成更廣泛的組織破壞，使 Ca2+大量快速內(nèi)流，使 Calpain 快速轉(zhuǎn)錄及翻譯，本實(shí)驗(yàn)所采取的模型為缺血再灌注模型，損傷程度輕于撞擊模型。Lee 等[9]發(fā)現(xiàn)，在兔的脊髓缺血再灌注損傷模型中，μ-Calpain 蛋白在造模后30 min 即有明顯的增加，并隨著時(shí)間的推移而下降。通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，μ-Calpain 蛋白的表達(dá)在不同的脊髓損傷模型和不同種屬之間的表達(dá)有可能是不相同的，這一點(diǎn)值得深入地研究。

α-II Spectrin 蛋白是細(xì)胞骨架蛋白之一，分子量為 230KD，在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)于神經(jīng)元的胞體、樹突及軸突，是 μ-Calpain 的特異性底物之一，可在 Calpain 蛋白的催化下降解為分子量為 150KD的 Cleaved α-II Spectrin。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脊髓缺血再灌注損傷后，μ-Calpain 蛋白的特異性底物α-II Spectrin 即出現(xiàn)降解，但在造模后的 6 h 才出現(xiàn)明顯降解，這與 μ-Calpain 蛋白在造模后升高的趨勢(shì)相同。α-II Spectrin 的降解說明細(xì)胞骨架蛋白逐漸被破壞，神經(jīng)組織發(fā)生潰變。μ-Calpain 在降解α-II Spectrin 的同時(shí)，還降解 NF200、68KD NFP等，使細(xì)胞骨架蛋白遭受進(jìn)一步破壞，提示可以將μ-Calpain 作為保留細(xì)胞結(jié)構(gòu)的治療靶點(diǎn)，保持神經(jīng)結(jié)構(gòu)的完整性。

本實(shí)驗(yàn)中，μ-Calpain 蛋白的升高和 α-II Spectrin的降解要早于 α-Calpain mRNA 的升高，這可能是在脊髓損傷發(fā)生后 Ca2+內(nèi)流首先激活了 μ-Calpain進(jìn)行細(xì)胞骨架的降解，同時(shí)通過其它機(jī)制先促使μ-Calpain 的翻譯增強(qiáng)，然后促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)。

脊髓損傷后的繼發(fā)性損傷導(dǎo)致了脊髓結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)一步破壞，μ-Calpain 作為 Ca2+的激活蛋白酶，參與了神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)纖維骨架蛋白的分解。本研究結(jié)果提示，如果能夠及時(shí)阻止 μ-Calpain 蛋白的轉(zhuǎn)錄及激活，有可能阻止細(xì)胞骨架蛋白的降解，保留神經(jīng)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而為神經(jīng)功能恢復(fù)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

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( 本文編輯：馬超 王萌 )

Expressions of μ-Calpain mRNA and protein after spinal cord ischemia-reperfusion injury

BU Guo-yun, DU Qu-cheng, WU Ye, DENG Shu-cai, ZHU Jia-liang, SHANG Wei-lin. Department of Spine Surgery, Tianjin Hospital, Tianjin, 300211, PRC

ObjectiveTo explore the expressions and signifcance of μ-Calpain after spinal cord ischemiareperfusion injury.MethodsAn adult Sprague-Dawley ( SD ) rat model of spinal cord ischemia-reperfusion injury was established. Quantitative real-time furoscent polymerase chin reaction ( PCR ) and Western-blot technique were used to detect the expressions of mRNA and protein of μ-Calpain at 2 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h after the model was established. The degradation of α-II specrin of the specifc substrate of of μ-Calpain was detected by Westernblot technique, and the results were compared with that of the control group.ResultsThe expressions of μ-Calpain mRNA of the injured spinal cord began to increase at 2 h after the model was established, but there were no statistically significant differences. The expressions were obviously increased at 12 h, and there were statistically significant differences ( P＜0.05 ). The peak was reached at 48 h after the model was established ( P＜0.001 ). The expressions of μ-Calpain mRNA remained at a higher level at 72 h when compared with that of the control group, and there were statistically signifcant differences ( P＜0.05 ). The expressions of μ-Calpain protein of the injured spinal cord began to increase at 2 h after the model was established, and the peak was reached at 48 h ( P＜0.001 ). The expressions of μ-Calpain protein remained at a higher level at 72 h after the model was established when compared with that of the control group, and there were statistically signifcant differences ( P＜0.05 ). The α-II spectrin began to degenerate at 2 h after the model was established, but there were no statistically signifcant differences. There were still some α-II spectrin remains at 72 h.ConclusionsThe expressions of μ-Calpain mRNA and protein are increased after the spinal cord ischemia-reperfusion injury model is established, and meanwhile the α-II specrin of its specifc substrate begins to degenerate. The μ-Calpain is involved in the pathological course of spinal cord ischemia-reperfusion injury.

Calpain; Spectrin; Reperfusion Injury; Spinal Cord Injuries

10.3969/j.issn.2095-252X.2014.12.014

：R683.2

全軍十二五面上項(xiàng)目 ( CWS11J100 )

300211 天津市天津醫(yī)院脊柱一科 ( 卜國云、鄧樹才 )；100048 北京，解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院骨二科( 杜區(qū)成、吳葉、朱加亮、商衛(wèi)林 )

吳葉，Email: wuyespine@126.com

2013-12-22 )