韓 濤，劉兆喆，郭 放，韓雅玲，謝曉冬

乳腺癌在我國發(fā)病率位居女性惡性腫瘤之首，病死率僅次于肺癌，其發(fā)生發(fā)展是多因素參與并相互作用的復(fù)雜過程［1］。涉及癌細(xì)胞本身、癌細(xì)胞與癌周微環(huán)境及宿主免疫狀態(tài)的多因素異常參與了乳腺癌的不良預(yù)后。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)不少的癌基因、生長因子等與乳腺癌細(xì)胞復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能成為乳腺癌的預(yù)后判斷指標(biāo)［2］。但因傳統(tǒng)的臨床預(yù)后指標(biāo)有其自身的局限性，尚不能完全反映乳腺癌的生物學(xué)特性。隨分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制被逐步闡明，尋找相關(guān)標(biāo)志物和干預(yù)靶點(diǎn)一直以來都是乳腺癌研究的熱點(diǎn)。細(xì)胞周期素 G1(cyclin G1)基因是1993年 Tamura等［3］在鼠成纖維細(xì)胞中尋找新的Src家族成員過程中發(fā)現(xiàn)的，定位于染色體5q32-q34區(qū)域。有6個(gè)外顯子，其cDNA 長約3．17 kb［4］。作為一種新的細(xì)胞周期素，cyclin G1 通過與 MDM2［5］、PP2A［6］等分子相互作用，參與了細(xì)胞多種生物學(xué)過程，如細(xì)胞周期和增殖［7-9］、DNA 損傷修復(fù)［10］、細(xì)胞凋亡［9，11-12］等。更重要的是，cyclin G1與抑癌基因p53關(guān)系密切，cyclin G1與p53結(jié)合，形成交互負(fù)反饋調(diào)節(jié)，提示該分子的異常表達(dá)可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用。近年來研究證實(shí)，cyclin G1高表達(dá)對成骨肉瘤細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、伯基特淋巴瘤等腫瘤細(xì)胞的生長有促進(jìn)作用，并且與急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性粒細(xì)胞白血病等惡性血液病密切相關(guān)［13-15］。本研究主要分析乳腺癌中cyclin G1的表達(dá)及其臨床意義，同時(shí)我們在此基礎(chǔ)上也初步評價(jià)了cyclin G1作為乳腺癌預(yù)后指標(biāo)和干預(yù)靶點(diǎn)的價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料和標(biāo)本收集 收集2003年1月—2008年10月，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院的78例女性乳腺癌手術(shù)切除冰凍組織、石蠟標(biāo)本及患者的相關(guān)臨床病理資料?；颊?9～83歲，中位年齡49歲，術(shù)前均未進(jìn)行任何放化療及生物治療，術(shù)后病理診斷均為浸潤性乳腺癌，隨訪120個(gè)月，中位生存時(shí)間101個(gè)月。在這78例乳腺癌組織中隨機(jī)選取22例乳腺癌及其癌旁組織抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的分析實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要抗體及試劑 兔抗人cyclin G1多克隆抗體(Santa Cruz公司);甲醇(上海試劑一廠，AR);無水乙醇(上海試劑一廠，AR);Syrb green(QIAGEN公司)。

1.3 儀器設(shè)備 熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀(Applied Biosystems公司)，免疫組化石蠟包埋機(jī)和免疫組化制片儀(Leica公司)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Realtime RT-PCR)檢測Realtime RT-PCR檢測乳腺癌及癌旁組織中cyclin G1 mRNA的表達(dá)，將上述組織碾碎分裝在1．5 ml Ep管中，用TRIzol?reagent收集組織，據(jù)試劑說明的步驟抽提RNA并做反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA用于熒光定量PCR檢測。目的基因的相對表達(dá)量經(jīng)內(nèi)參標(biāo)化后分析。最終獲得其相對定量值，用癌減去癌旁的相對定量值取對數(shù)。使用的引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。cyclin G1上游引物序列:5'-AAGCAGCTCAGTCCAACACA-3';cyclin G1下游引物序列:5'-TGGCTTTGACACAGAGACATTT-3'，以人β-actin作為內(nèi)參，引物的上游序列:5'-GGCATCGTGATGGACTCCG-3'，下游序列:5'-GCTGGAAGGTGGACAGCGA-3。PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性10 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，72℃終末延伸10 min。

1.5 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定 所有標(biāo)本均行4 mm連續(xù)切片，石蠟包埋，應(yīng)用cyclin G1多抗進(jìn)行免疫組化SP法染色。具體操作步驟:石蠟切片脫蠟至水，3%過氧化氫室溫孵育10 min，以清除內(nèi)源性過氧化物酶的活性;抗原微波熱修復(fù)3 min，抗原修復(fù)液為pH 6．0檸檬酸緩沖液;3．5% ～10%正常山羊血清封閉非特異性位點(diǎn)，室溫孵育10 min;傾去血清，滴加cyclin G1一抗工作液，37℃孵育過夜;滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液，濕盒中孵育20 min;滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，濕盒中孵育20 min。上述步驟之間均用0．01 M PBS(pH=7．4)沖洗。進(jìn)行DAB染色，自來水沖洗、蘇木素復(fù)染細(xì)胞核、封片。結(jié)果判定:細(xì)胞胞漿或細(xì)胞膜呈清晰黃褐色顆粒為陽性表達(dá)。高倍鏡(×400)下隨機(jī)觀察5個(gè)視野，根據(jù)陽性細(xì)胞百分率和染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析，染色強(qiáng)度:無染色0分，染色弱但強(qiáng)于陰性對照記1分，染色清晰記2分;陽性細(xì)胞數(shù) ＜10%記0分，10% ～25%記1分，25% ～50%記2分，＞50%記3分。兩項(xiàng)指標(biāo)積分之和0～1分為陰性病例(－)，1～2分為弱陽性病例(+)，2～3分為陽性病例(++)，≥3分為強(qiáng)陽性病例(+++)。由兩位病理科醫(yī)師雙盲法計(jì)數(shù)，差異超過10%需重新計(jì)數(shù)［16］。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析方法 應(yīng)用SPSS 18．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料的均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率的比較采用Log rank檢驗(yàn)。將單因素分析中有意義的各變量用向后逐步回歸法進(jìn)行Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析。α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 cyclin G1在乳腺癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)情況 組織學(xué)水平上檢測了78例乳腺癌及其癌旁組織中cyclin G1的表達(dá)情況，見圖1，cyclin G1在乳腺癌中的表達(dá)評分為(1．93±0．77)分，顯著高于癌旁組織中的表達(dá)評分(1．31±0．67)分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．01)。

2.2 Realtime-PCR實(shí)驗(yàn) cyclin G1在18例乳腺癌中的表達(dá)(81．8%)高于癌旁組織中的表達(dá)，見圖2，其中癌組織中cyclin G1表達(dá)為3．62±1．64，癌旁組織中cyclin G1表達(dá)為2．96±1．93，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．01)。

2.3 cyclin G1的表達(dá)與臨床病理特征 以本組乳腺癌組織中cyclin G1表達(dá)評分的中位數(shù)為界值(中位數(shù)為2)，高于此界值定義為cyclin G1高表達(dá)組，低于此界值定義為cyclin G1低表達(dá)組。cyclin G1高、低表達(dá)組的臨床特征如下表1，三陰乳腺癌患者主要集中在cyclin G1高表達(dá)組(93．3%)，其中高表達(dá)組中cyclin G1表達(dá)量為2．52±0．44，低表達(dá)組中cyclin G1 表達(dá)量為1．32±0．54，cyclin G1 高低兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0．05)。

圖1 細(xì)胞周期素G1在乳腺癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)(DAB×200) A．乳腺癌;B．癌旁組織

圖2 細(xì)胞周期素G1在22例乳腺癌組織中的表達(dá)

2.4 cyclin G1表達(dá)和預(yù)后生存時(shí)間 乳腺癌組織中cyclin G1低表達(dá)者與高表達(dá)者相比，其5年總體生存率有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0．05)，見圖3。cyclin G1高表達(dá)組生存期為(81．282±38．782)個(gè)月，低表達(dá)組生存期為(95．538±30．783)個(gè)月，乳腺癌組織中cyclin G1表達(dá)越高，預(yù)后越差。

2.5 cyclin G1表達(dá)與三陰乳腺癌的生存分析 將cyclin G1的表達(dá)與乳腺癌是否三陰進(jìn)行聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)cyclin G1高表達(dá)的三陰乳腺癌患者預(yù)后最差(中位生存期49個(gè)月)，cyclin G1低表達(dá)的三陰乳腺癌患者和cyclin G1高表達(dá)的非三陰乳腺癌患者預(yù)后也較差，cyclin G1低表達(dá)的非三陰乳腺癌預(yù)后最好(中位生存期117個(gè)月)?？傊琧yclin G1高表達(dá)的三陰乳腺癌患者、cyclin G1低表達(dá)的三陰乳腺癌患者、cyclin G1高表達(dá)的非三陰乳腺癌患者、cyclin G1低表達(dá)的非三陰乳腺癌患者預(yù)后之間進(jìn)行多重比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0．05)，見圖4。

2.6 cyclin G1表達(dá)與預(yù)后 通過Chi-square檢驗(yàn)對影響乳腺癌患者總體生存期的臨床各種指標(biāo)行單因素分析，結(jié)果如表2所示;通過單因素分析篩選出對乳腺癌總體生存期有意義的變量納入多因素分析，通過建立Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，提示乳腺癌中cyclin G1表達(dá)對于總體生存率為獨(dú)立的預(yù)后因子，乳腺癌組織中cyclin G1高表達(dá)者相對cyclin G1低表達(dá)者對于總體生存率的相對危險(xiǎn)度HR=2.837，95%可信區(qū)間為1．196 ～6.728，P=0．02。

表1 細(xì)胞周期素G1高、低表達(dá)組乳腺癌的臨床特征［例(%)］

圖3 細(xì)胞周期素G1的表達(dá)與乳腺癌預(yù)后的相關(guān)性分析

圖4 細(xì)胞周期素G1的高低表達(dá)與是否為三陰乳腺癌聯(lián)合分析對預(yù)后的影響

表2 變量的單因素分析和多因素分析

3 討論

乳腺癌在發(fā)達(dá)國家居女性腫瘤第一位［17］，新研究提示某些癌基因及受體的表達(dá)不僅能夠判定乳腺癌的預(yù)后，而且對指導(dǎo)乳腺癌治療具有重要意義。cyclin G1是發(fā)現(xiàn)較晚的一類細(xì)胞周期蛋白，被報(bào)道可以和 MDM2［5］，PP2A［6］等分子相互作用，廣泛參與了細(xì)胞多種病理生理過程，在細(xì)胞凋亡、周期調(diào)控和DNA損傷修復(fù)等過程發(fā)揮重要作用。一系列研究發(fā)現(xiàn)，cyclin G1在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用，cyclin G1的高表達(dá)對成骨肉瘤細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞的生長有促進(jìn)作用，另外其與急性淋巴細(xì)胞白血病、慢性粒細(xì)胞白血病等血液系統(tǒng)惡性腫瘤有關(guān)。最新的研究表明，cyclin G1還參與調(diào)控肝癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的過程［18］，并對肝癌起始細(xì)胞起到了促進(jìn)和維持作用［19］。盡管cyclin G1已被證明是重要的腫瘤調(diào)節(jié)蛋白，但是其在乳腺癌中的表達(dá)及和乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系國內(nèi)外尚無任何報(bào)道。本研究首先在78例乳腺癌和癌旁組織中進(jìn)行組織學(xué)檢測并在22例乳腺癌和癌旁組織中進(jìn)行cyclin G1的轉(zhuǎn)錄水平檢測，結(jié)果均支持cyclin G1在乳腺癌中表達(dá)顯著高于癌旁組織中的表達(dá)，這提示我們cyclin G1有可能在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要癌基因的作用。

在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上我們又進(jìn)一步分析了cyclin G1的表達(dá)和乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，通過生存分析發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中cyclin G1表達(dá)和預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，cyclin G1高表達(dá)者與低表達(dá)者相比，其5年總體生存率明顯降低，結(jié)果具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0．05)。據(jù)研究顯示，按照激素受體分子分型，乳腺癌中還存在一種特殊的亞型，三陰乳腺癌［20］，即ER、PR、HER-2表達(dá)均為陰性的乳腺癌，約占乳腺癌的15%，因其浸潤性較強(qiáng)、缺乏內(nèi)分泌及分子靶向治療常常與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高、生存時(shí)間短等不良預(yù)后相關(guān)［21-22］。我們在研究中著重分析了cyclin G1分子在三陰乳腺癌和非三陰乳腺癌中的表達(dá)變化，結(jié)果顯示cyclin G1在三陰乳腺癌中表達(dá)明顯高于非三陰乳腺癌，這提示cyclin G1有可能參與了三陰乳腺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。而當(dāng)我們將cyclin G1與三陰乳腺癌聯(lián)合起來對乳腺癌預(yù)后進(jìn)行分析判斷時(shí)發(fā)現(xiàn)cyclin G1高表達(dá)的三陰乳腺癌患者預(yù)后最差，cyclin G1低表達(dá)的三陰乳腺癌患者和cyclin G1高表達(dá)的三陰乳腺癌患者預(yù)后也較差，cyclin G1低表達(dá)的非三陰乳腺癌預(yù)后最好;這提示cyclin G1的表達(dá)與乳腺癌是否三陰相結(jié)合判斷可以顯著提高乳腺癌的預(yù)后判斷效果。

綜上所述，本研究探討了cyclin G1與乳腺癌表達(dá)及預(yù)后的關(guān)系，從基因水平和組織學(xué)水平檢測了乳腺癌樣品中cyclin G1的表達(dá)情況，并結(jié)合乳腺癌患者的預(yù)后隨訪資料分析臨床樣本中cyclin G1的表達(dá)情況與預(yù)后的關(guān)系，并進(jìn)一步分析cyclin G1與三陰乳腺癌的預(yù)后聯(lián)合判斷效果。為cyclin G1作為臨床上乳腺癌預(yù)后判斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)，并為乳腺癌患者的個(gè)體化治療和預(yù)后判斷提供重要的理論意義和潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。

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