葉 覃，Andreana HOLOWATYJ，Roselyne M.LABBE，劉 輝，Zengquan YANG

組蛋白去甲基化酶家族中組蛋白去甲基化酶4作用機制及其應用的研究進展

葉 覃，Andreana HOLOWATYJ，Roselyne M.LABBE，劉 輝，Zengquan YANG

組蛋白甲基化是一種重要的表觀遺傳性修飾方式，是一個可逆的動態(tài)調(diào)節(jié)過程。組蛋白去甲基化酶家族中組蛋白去甲基化酶4能催化去除組蛋白賴氨酸殘基甲基標記，調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結構，參與精細調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，維持染色質(zhì)的活性和非活性平衡。組蛋白去甲基化酶4異?？赡軐е录毎鲋?、分化、個體發(fā)育、能量代謝及腫瘤發(fā)生發(fā)展等多種生物進程異常。研究顯示組蛋白去甲基化酶4可作為新的藥物靶標。本文就組蛋白去甲基化酶4家族的結構、作用機制、在疾病發(fā)生發(fā)展進程中的生物學功能及特異性抑制劑開發(fā)的最新研究進展作一綜述。

組蛋白去甲基化酶；組蛋白去甲基化酶4；腫瘤

核小體是染色質(zhì)的基本組成單位，由核心組蛋白H2A、H2B、H3、H4各2分子構成的八聚體和纏繞1.75圈的146 bp DNA組成。組蛋白氨基末端可發(fā)生乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化等多種修飾，影響染色質(zhì)結構，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，其中組蛋白甲基化是組蛋白主要的修飾形式之一。甲基化組蛋白與不同效應蛋白協(xié)同參與調(diào)控異染色質(zhì)形成、X染色體失活、特定基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、基因組完整性及細胞發(fā)育等多種生物學效應。組蛋白甲基修飾是甲基化酶和去甲基化酶動態(tài)相互作用的結果。最近研究表明組蛋白甲基化異?？蓪е禄蝈e誤表達，引起發(fā)育異常、代謝紊亂、疾病甚至腫瘤的發(fā)生［1-2］。本文就組蛋白去甲基化酶4（lysine-specific demethylase 4，KDM4）家族的結構、作用機制、在疾病發(fā)生發(fā)展進程中的生物學功能及特異性抑制劑開發(fā)的最新研究進展作一綜述。

1 組蛋白去甲基化酶

組蛋白去甲基化酶作用位點主要為組蛋白H3上的賴氨酸（K）殘基，包括H3上的K4、K9、K27和K36。通常H3K4、H3K36位點甲基化修飾介導基因轉(zhuǎn)錄活化，H3K9、H3K27的甲基化修飾則介導轉(zhuǎn)錄抑制。目前已知有兩大類組蛋白賴氨酸去甲基化酶家族：一類屬于氨基酸氧化酶家族，包括賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1（lysine-specific demethylase 1，LSD1／KDM1A）和LSD2（KDM1B）［3］；另一大類是含Jumonji C（JmjC）結構域的組蛋白去甲基化酶。這類去甲基化酶需要二價鐵離子（Fe2＋）和α-酮戊二酸為輔助因子，通過羥基化作用使組蛋白賴氨酸去甲基。在人類基因組中含有32個JmjC家族成員，其中24個證實有去甲基化酶活性，根據(jù)功能和不同的結構域組合又可細分為7個亞家族（KDM2-8）［2，4-6］。

2 KDM 4的結構和正常功能

KDM4是最大的JmjC去甲基化酶亞家族之一，在人類基因組中含有6個KDM4基因（KDM4A-F）。KDM4A-C基因編碼的蛋白相對分子質(zhì)量大約130× 103大小，分別含有1個JmjN和1個JmjC功能域，2個PHD和2個Tudor功能域；而KDM4D和KDM4E編碼的蛋白缺少PHD和Tudor功能域，大小只有前3個成員的一半（圖1）［7-8］。其中KDM4E最近才被證實是一個功能基因，和KDM4E結構類似的KDM4F是個假基因［2］。KDM4A-C能催化去除H3K9和H3K36三甲基和二甲基（me3／me2）標記，而KDM4D只能催化去除H3K9me3／me2標記，KDM4E則可催化H3K9me3和H3K56me3甲基基團的去除。KDM4各個成員在機體不同組織中表達水平不同：KDM4A-C在正常人體組織中廣泛表達，在脾臟、卵巢及結腸有高表達；KDM4D和KDM4F在睪丸中高表達，在其他組織則較低或幾乎無表達［2，9］。

圖1 KDM4A-D的蛋白結構

KDM4參與調(diào)控正常發(fā)育過程，KDM4的雙純合子敲除果蠅個體在二齡幼蟲期就死亡［10］；KDM4雜合子敲除果蠅DNA對紫外光照射則更加敏感［11］；敲除KDM4基因的線蟲出現(xiàn)生殖細胞凋亡以及DNA復制速度降低［12］；條件敲除心臟特異KDM4A轉(zhuǎn)基因小鼠會促進心肌肥厚性刺激的反應［13］；乳腺上皮細胞敲除KDM4B會延遲乳腺發(fā)育［14］。KDM4還參與發(fā)育過程中維持胚胎干細胞中染色體結構開放狀態(tài)；誘導Oct4（POU class 5 homeobox 1）、Sox2（sex determining region Y-box）2和Myc（v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog）等多能性因子的表達，調(diào)控胚胎發(fā)育過程中細胞分化的類型等［15-16］。另外，最新研究發(fā)現(xiàn)KDM4B和KDM4C在胚胎干細胞的自我更新和誘導多能干細胞的產(chǎn)生中具有各自獨特的，但又相互配合的重要作用［17］。

3 KDM 4與疾病

自2006年KDM4被證明以來，研究人員對KDM4的活性進行了充分地鑒定，并發(fā)現(xiàn)KDM4在腫瘤及其他疾病的發(fā)生發(fā)展過程中可發(fā)揮重要的作用。下面就KDM4家族各成員與疾病特別是在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用作一簡述。

3.1 KDM4A 許多研究表明KDM4A在多種腫瘤中都有異常擴增或高表達，并可促進腫瘤細胞的侵襲性生長和轉(zhuǎn)移［2］。分析1 770個8類腫瘤患者組織樣本后，Black等［18］在18.7%的腫瘤中發(fā)現(xiàn)KDM4A基因拷貝的異常擴增；在卵巢癌，高達46%樣本中有KDM4A的擴增；基因拷貝數(shù)變化直接決定KDM4A蛋白表達的增加或減少，而KDM4A過度表達會導致1q12、1q21以及Xq13.1特定位點基因拷貝數(shù)增加，但并不會引起全基因組染色體不穩(wěn)定。Black的研究成果揭示組蛋白去甲基化酶異常表達可誘導包含原癌基因特定基因位點的拷貝數(shù)增加，為腫瘤細胞基因拷貝數(shù)變異提供一新的的分子機制。Ding等［19］發(fā)現(xiàn)KDM4A可改變轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白（activator protein 1，AP-1）的分子激活過程，對鱗狀細胞癌的侵襲性生長和轉(zhuǎn)移起重要促進作用。機制研究表明，KDM4A的組蛋白去甲基化作用促進了AP-1復合物結合細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子C-JUN和FOSL1（FOS like antigen 1）啟動子，從而促進AP1激活的一個重要正反饋環(huán)。在人類鱗狀細胞癌組織樣本中，研究人員證實淋巴結轉(zhuǎn)移灶中的KDM4A表達升高。在小鼠模型中，下調(diào)／敲除KDM4A的表達可顯著抑制鱗狀細胞癌侵襲和擴散。因此，KDM4A可能為抑制鱗狀細胞癌侵襲性生長和轉(zhuǎn)移提供了一個新的的治療靶點。

3.2 KDM4B KDM4B結構、底物特異性和體外酶活性都與KDM4A非常相似，而且功能密切相關［2］。研究顯示KDM4B異常表達不僅與腫瘤發(fā)生發(fā)展以及惡性程度密切相關，還參與腫瘤細胞缺氧應激反應［20-21］。KDM4B作為雌激素受體（estrogen receptor，ER）靶向基因，能與ER形成一個功能復合體，調(diào)控ER靶向相關基因的轉(zhuǎn)錄活性。因此，KDM4B表達下調(diào)會抑制ER陽性乳腺癌細胞系MCF7或T47D細胞增殖和體外成瘤體積，但是ER陰性細胞系MDA-MB-231細胞增殖不受KDM4B表達水平影響［14，22］。與此相對應，KDM4B異常高表達在ER陽性乳腺癌更為普遍［14］。另外，KDM4B可和H3K4甲基化酶MLL2形成復合體，協(xié)同調(diào)控ER靶向相關基因的轉(zhuǎn)錄活性［23］。最新研究發(fā)現(xiàn)，KDM4B能直接調(diào)控ER和ER信號級聯(lián)通路中的關鍵轉(zhuǎn)錄增強子FOXA1（forkhead box A1）的表達。因此，KDM4B可通過ER信號級聯(lián)通路在乳腺癌的形成和進展中發(fā)揮重要作用［22］。在前列腺癌中，雄激素受體（androgen receptor，AR）可調(diào)控KDM4B表達，而KDM4B又可和AR結合。不僅利用去甲基化作用增強AR靶向相關基因的轉(zhuǎn)錄，而且能通過泛素化修飾抑制AR蛋白降解。因此，KDM4B可與AR形成一個信號級聯(lián)通路正反饋環(huán)，促進前列腺癌的形成和進展［24］。

3.3 KDM4C KDM4C，也稱為鱗狀細胞癌增強蛋白1抗體（gene amplified in squamous cell carcinoma 1，GASC1），最初是從食管鱗狀細胞癌系中克隆出來的一個高度擴增的基因［25］。研究顯示，KDM4C在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、淋巴癌及髓母細胞瘤等多種腫瘤中都有擴增或異常高表達，并且與腫瘤的惡性程度密切相關［2，26-27］。我們實驗室發(fā)現(xiàn)，KDM4C擴增在乳腺癌中約占15%，與KDM4B相反，其擴增或異常高表達在高度侵襲性的基底型乳腺癌更為普遍。我們實驗室證明了KDM4C高表達可誘導正常乳腺上皮細胞轉(zhuǎn)化和惡性增值。降低KDM4C表達可抑制乳腺癌生長和轉(zhuǎn)移［27-28］。在機制上，KDM4C可通過H3K9去甲基化作用促進原癌基因c-MYC、MDM2（MDM2 oncogene，E3 ubiquitin protein ligase）、NOTCH1或多能性因子Oct4、NANOG的轉(zhuǎn)錄，從而誘導細胞轉(zhuǎn)化和促進腫瘤干細胞增殖［16，27，29-30］。另外，KDM4C可與缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor 1，HIF1）結合，是乳腺癌生長和轉(zhuǎn)移所需的HIF1的輔激活因子。KDM4C可降低HIF1的靶基因位點上H3K9me3的水平，進而活化包括賴氨酰氧化酶樣蛋白2和L1細胞黏附分子的HIF1靶基因，促進乳腺癌的轉(zhuǎn)移［28］。KDM4C可以與雄激素受體AR形成復合體，共同刺激AR和依賴AR生長的前列腺腫瘤細胞增殖，參與前列腺癌腫瘤發(fā)生過程［31］。特別的是KDM4C也能夠催化非組蛋白Pc2（polycomb 2 protein）去甲基化，激活細胞生長調(diào)控基因［32］。

3.4 KDM4D和KDM4E KDM4家族成員KDM4D，沒有PHD和Tudor功能域，不能催化H3K36位點去甲基化，但是能催化H3K9me3／me2及H1.4K26me3的去甲基化作用［2］。KDM4D與AR共激活，參與前列腺癌細胞的擴增和殺傷逃逸［33］；KDM4D調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境和免疫細胞生長，如腫瘤壞死因子-α能誘導KDM4D在樹突細胞和巨噬細胞中表達參與炎癥通路［34］；KDM4D能刺激p53依賴基因的表達［35］。有意思的是KDM4D刺激結腸癌細胞增殖和促進AR活性表現(xiàn)出原癌基因的特征，但是激活p53依賴基因的轉(zhuǎn)錄卻起著抑癌基因作用，在腫瘤形成過程中KDM4D作用具有促癌和抑癌的雙面性。KDM4E以前被認為是假基因，沒有生物功能，最近才發(fā)現(xiàn)具有生物活性，但是尚需要更深入的實驗證實［2］。

4 KDM 4抑制劑

KDM4對染色體的結構修飾和基因表達調(diào)控發(fā)揮著重要的作用，通過抑制KDM4活性，調(diào)控組蛋白異常甲基化狀態(tài)可抑制或殺傷腫瘤細胞。因此，KDM4可以作為腫瘤治療和藥物篩選的新靶點，針對KDM4家族抑制劑的研究也成為藥物化學的一個研究熱點［36-37］。根據(jù)去甲基化酶JmjC結構域的三維結構和它們的催化機制，已有多個KDM4抑制劑的研究開發(fā)報道［2，37］。按照作用機制，已報道的抑制劑可分為輔助因子α-酮戊二酸類似物、金屬輔因子干擾物及組蛋白底物類似物3類。

4.1 輔助因子α-酮戊二酸類似物 KDM4是α-酮戊二酸和鐵離子依賴酶。目前絕大多數(shù)KDM4抑制劑是輔助因子α-酮戊二酸類似化合物，其可競爭性結合在鐵離子與酶結合的催化位點，抑制JmjC去甲基化酶家族多個成員的去甲基化酶活性［2，37］。Hamada等［38］利用一種α-酮戊二酸類似物氨基化合物乙二酰氨基乙羧酸（N-Oxalyl glycine，NOG）作為藥物骨架，設計了多種新型的α-酮戊二酸類似物KDM4抑制劑，如NCDM-32，并發(fā)現(xiàn)其對KDM4C抑制劑效率比其他NOG骨架抑制劑對KDM4C活性抑制效率高500倍、特異性高9 100倍。其他α-酮戊二酸類似物有植物生長調(diào)節(jié)劑diaminozide、2，4-pyridindicarboxylic酸（PDCA）、PDCA衍生物5-carboxy-8-hydroxyquinoline（5-Carboxy-8HQ）和2，2-聯(lián)吡啶衍生物的4-羧酸鹽（Bipyridine A）［2，39］。人體中有70～80個利用α-酮戊二酸的加氧酶，如缺氧誘導因子和脯氨酰羥化酶1-3。因此，α-酮戊二酸類似物靶向特異性差，限制了這類抑制劑在實驗或治療中的應用。

4.2 金屬輔因子干擾物 非鐵金屬離子如鎳，或者有機化合物，競爭結合到KDM4上二價鐵離子結合位點，可抑制其催化活性［40］。另外，結構和生物信息學分析發(fā)現(xiàn)KDM4催化結構域有鋅離子的結合位點，其他的組蛋白去甲基化酶家族或者是α-酮戊二酸加氧酶都沒有這個位點，并且鋅離子的結合位點與KDM4-組蛋白賴氨酸結合位點非常相近。因此，鋅離子蛋白結合抑制化合物，如雙硫侖（disulfiram）和依布硒（ebselen），可通過移除鋅離子，選擇性的抑制KDM4催化活性［41］。

4.3 組蛋白甲基賴氨酸類似物 組蛋白甲基賴氨酸類似物能與KDM4去甲基化酶組蛋白底物競爭結合，達到抑制酶活性的作用。底物模擬設計需要考慮到KDM4是多個功能域形成一個特殊的籠裝結構，參與組蛋白識別。最近，篩選天然產(chǎn)物的文庫中抑制KDM4C活性的研究發(fā)現(xiàn)兒茶酚（catechols）可能直接或間接的與去甲基化酶組蛋白底物競爭結合，抑制KDM4C活性［42］。Luo等［43］根據(jù)組蛋白去乙酰化酶（distone deacetylase，HDAC）抑制劑MS-275的分子框架，設計出同時包含組蛋白甲基賴氨酸類似物和α-酮戊二酸輔助因子類似物的雙結構去甲基化酶抑制劑。這樣的設計既能降低輔助因子類似物對非靶向性加氧酶抑制，提高抑制劑的特異性；同時，又能抑制去甲基化酶與底物結合，抑制酶活性。體外實驗證明這種化合物能抑制KDM4A、KDM4C和KDM4E的活性。更為重要的是其藥物前體Methylstat可抑制KDM4C擴增的食管鱗狀細胞癌KYSE150細胞系的惡性增值［43］。

最近，Wang等［44］篩選抑制腫瘤細胞生長的化合物，發(fā)現(xiàn)了一種與上述抑制劑結構不同的去甲基化酶抑制劑JIB-04。生化分析，JIB-04可有效抑制KDM4成員，包括KDM4A、KDM4B、KDM4C和KDM4E的催化活性。JIB-04不是輔助因子α-酮戊二酸類似物，并且確切的分子機制尚不清楚。然而，JIB-04似乎不影響其他α-酮戊二酸依賴性酶的功能，也不影響正常細胞的生長；但可抑制腫瘤細胞去甲基化酶的功能，抑制腫瘤細胞生長。正因為如此，這種抑制劑可能代表一種新的表觀遺傳學藥物類型，用于開發(fā)新的抗腫瘤藥物。

5 展望

在組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶的協(xié)同調(diào)控下，細胞中組蛋白甲基化和去甲基化的過程處于動態(tài)平衡。KDM4與多能性因子、核激素受體等相互結合精確調(diào)控基因表達及其他與染色質(zhì)有關的功能，參與胚胎發(fā)育及腫瘤發(fā)生等多個生物進程。自2006年發(fā)現(xiàn)KDM4以來，已對其生物學功能及在疾病，特別是在腫瘤發(fā)生發(fā)展進程中的作用進行了多方面研究。很顯然，我們對KDM4的分子作用機制仍然知之甚少。例如，KDM4A、KDM4B和KDM4C的結構和功能團非常相似，其均可催化H3K9和H3K36的去甲基化。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)在不同的細胞類型中三者可能既有共同的，又具有各自獨特的生物功能。然而，我們對KDM4A、KDM4B和KDM4C在不同的細胞類型及疾病中的生物學作用仍知之不多。再者，KDM4應與轉(zhuǎn)錄因子及其他的蛋白質(zhì)形成復合體，然后被招募到特定基因位點，調(diào)控特定的下游基因，發(fā)揮其生物學作用。我們對KDM4復合體組成及在生理和病理狀態(tài)的作用和分子機制仍不清楚。因此，深入了解KDM4各成員在生理和病理狀態(tài)下的生物學作用和分子機制將是未來研究的一個重要組成部分?？紤]到KDM4在多種腫瘤中都有異常擴增或高表達，并可促進腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移，KDM4抑制劑有希望成為一種新型抗腫瘤藥物。然而，需要注意的是目前報道的KDM4抑制劑特異性不高，因此可以預料KDM4研究的下一個十年將專注于開發(fā)具有高特異性KDM4抑制劑。這類抑制劑分子將為KDM4在腫瘤發(fā)生發(fā)展進程中的分子機制研究提供一個新的工具，并有希望成為能用于臨床的抗腫瘤藥物。

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The emerging functions and therapeutic application of the histone lysine demethylase lysine-specific demethylase 4 subfamily

YE Qin1，2，Andreana HOLOWATYJ1，Roselyne M．LABBE1，LIU Hui1，3，Zengquan YANG1
（1.Karmanos Cancer Institute，Department of Oncology，Wayne State University，Detroit，MI 48201，USA；2.College of Llife Science，Jiangsu Normal University，Jiangsu Xuzhou 221116，China；3.Key Laboratory of Pathology Biology，Ministry of Education，School of Basic Medical Sciences，Jilin University，Jilin Changchun 130021，China）

Histone lysine methylation，a covalent histone modification，plays a central role in epigenetic regulation networks of genome function.The histone lysine demethylase（KDM）4 subfamily catalyzes the removal of methyl marks from histone lysine residues to epigenetically regulate chromatin structure，cell cycle，genome integrity and gene expression.Dysregulation of the KDM4 demethylases is associated with abnormities of cell proliferation and differentiation，development and metabolism，aswell as tumorigenesis.Furthermore，KDM4 demethylases are promising druggable targets due to their enzymatic activity.In this review，we summarize recent findings regarding the structures and regulatory mechanisms of the KDM4 proteins，aswell as our current understanding of their alterations and roles in human disease.We also review the reported KDM4 inhibitors and discuss their potential as therapeutic agents.

Lysine-specific demethylase；Lysine-specific demethylase 4（KDM4）；Tumour

Q55；R73

A

2095-3097（2014）01-0013-06

10.3969／j.issn.2095-3097.2014.01.004

2013-06-18 本文編輯：徐海琴）

Karmanos Cancer Institute-SRIG；江蘇師范大學?；穑?9XLA08、11XLR25）

MI 48201 Detroit USA，Karmanos Cancer Institute，Department of Oncology，Wayne State University（葉 覃，Andreana HOLOWATYJ，Roselyne M.LABBE，Zengquan YANG）；221116江蘇徐州，江蘇師范大學生命科學學院（葉 覃）；130021吉林長春，吉林大學白求恩醫(yī)學院病理生物學教育部重點實驗室（劉 輝）