付 嬈

(東北電力大學化學工程學院，吉林吉林132012)

金納米粒子可以與多種類型生物分子發(fā)生相互作用［1－4］，DNA吸附在粒子表面后，在生物醫(yī)學和生物分析中得到了廣泛的應用［5－10］。以往工作都是利用靜電作用實現(xiàn)DNA的吸附［11－19］，但是在一些復雜體系中DNA在粒子表面的吸附機制并不十分明確，而且在吸附過程中往往會由于非特異性吸附而引入一些其他小分子雜質(zhì)，而對后續(xù)的研究工作產(chǎn)生了不利影響。要解決這些問題，就要明確DNA與粒子之間的作用。研究發(fā)現(xiàn)，將金屬離子加入到DNA溶液中后，金屬離子能夠通過與DNA分子中的磷酸根絡合而引起DNA分子鏈的卷曲［20］，而這種配位作用往往要大于靜電作用。這為我們改善粒子對DNA的吸附提供了新的思路。我們可以利用這種配位作用將DNA最大程度地吸附到粒子表面，而且這種配位作用對鹽濃度不敏感并具有很好的選擇性，可以避免對其他雜質(zhì)的非特異性吸附。另外，利用DNA的惰性部位磷酸根進行反應可以充分保留DNA的活性部位，使DNA可以更好地進行后續(xù)反應。因此，在本章中，我們研究了表面修飾了Fe3+離子的金納米粒子對DNA的吸附和脫附行為。利用Fe3+離子與DNA分子中磷酸根的配位作用可以實現(xiàn)在低pH條件下DNA分子在金納米粒子表面的高效吸附。這種基于配位作用的吸附效率要高于鹽橋作用，而且不會受到溶液中鹽濃度的影響。

1 實驗部分

1.1 試劑與藥品

鮭魚精 DNA(BR)，谷胱甘肽(＞98%，C10H17N3O6S，F(xiàn)W 307.33)，氯金酸(99.9+%，HAuCl4·3H2O，F(xiàn)W 393.8)，檸檬酸鈉(99.9+%，HAuCl4·3H2O，F(xiàn)W 393.8)，硫酸鎳(≥99%，NiSO4·7H2O，F(xiàn)W 280.86)，三氯化鐵(＞99%，F(xiàn)eCl3·6H2O，F(xiàn)W 270.21)，氯化鈉(AR，NaCl，F(xiàn)W 58.44)購買于 Sigma－Aldrich 公司。金溶膠的pH值通過NaOH(0.1 mol/L)和HCl(0.1 mol/L)水溶液來調(diào)節(jié)。實驗中所有溶液均用電阻率為18 MΩ·cm的高純水配制。

1.2 測試儀器

紫外吸收測試采用型號為Cary－100紫外吸收光譜儀。動力學光散射測試采用Brookhaven儀器公司出品的型號為BI－90Plus的粒度分析儀，散射角度為90°。透射電子顯微鏡(TEM)為Hitachi H－8100Ⅳ型電子顯微鏡;紅外光譜利用Perkin－ElmerSpectrum One FTIR光譜儀測試，將金納米粒子樣品滴加在CaF2薄片中間，置于持續(xù)通氣的樣品室中。離心機為德國Sigma3K－30型離心機。pH計為北京Sartorius公司PB－20型pH計。實驗所有圖片采用DiMAGE Z2數(shù)碼相機采集。所有實驗在室溫下進行，溫度為25±2℃。

1.3 金納米粒子的表面修飾

用檸檬酸還原氯金酸的方法合成金納米粒子［21］。250 mL三頸瓶中加入95 mL，0.48 mmol/L的氯金酸，在400 r/min攪拌下加熱至沸騰。沸騰30S后，快速加入5 mL，1.94 mmol/L檸檬酸鈉溶液，保持沸騰狀態(tài)反應1 5min后關閉熱源，繼續(xù)攪拌至室溫。如此制得金溶膠濃度為290 μmol/L，pH值為6.5左右。透射電鏡測試金納米晶的粒徑為17.9±1 nm。動態(tài)光散射數(shù)據(jù)顯示金納米晶的多分散性為4.8%。紫外吸收光譜給出最大吸收峰位在518 nm左右。將金納米粒子以8 000 r/min分，離心30 min后重新分散于高純水中，以達到提純的目的。先用0.1 mol/L的NaOH將離心提純后的金粒子的pH值調(diào)到9.0，然后將60 μmol/L的谷胱甘肽溶液加入到金溶膠中。反應2.5 h后，通過離心提純的方法去除溶膠當中過剩的谷胱甘肽，最終得到濃度為3.17×10－9mol/L的谷胱甘肽修飾的金納米粒子溶膠，其pH值為6.4左右。用0.1 mol/L的NaOH分別將金溶膠調(diào)至不同的pH值(3.0－9.0)，然后加入50 μmol/L的Fe3+離子。測試前，樣品放置5 min，每種樣品測試至少重復5次。

1.4 金粒子螯合Fe3+離子后對DNA的吸附和脫附過程

將100 μL，1000 μg/mL的鮭魚精DNA水溶液加入表面修飾Fe3+離子的金納米粒子水溶液中，DNA和金納米粒子的混合溶液在pH3.0－9.0下室溫搖床振蕩1 h。離心后取上清液，測試上清中剩余的DNA濃度［22，23］。金納米粒子對DNA的吸附效率由公式ηad=(OD0－ODL)/OD0計算得到，其中吸光度OD0代表混合溶液中初始DNA的濃度，吸光度ODL代表離心后上清液中DNA的濃度。測量DNA的脫附效率時，把在pH3.0的混合溶液中吸附DNA達到飽和的金納米粒子離心分離后分散在不同pH值的水溶液中，搖床振蕩1 h后離心，測試上清液中的DNA濃度。金納米粒子對DNA的脫附效率由公式ηde=ODR/OD0－ODL計算得到，其中吸光度ODR代表從納米粒子上脫附下來的DNA的濃度。用NaOH(0.1 mol/L)和HCl(0.1 mol/L)的水溶液來調(diào)節(jié)金溶膠的pH值。將金納米粒子對DNA吸附和脫附的量與金粒子的質(zhì)量做比值，得到對DNA的絕對吸附和脫附量(mg/mg)。

2 結(jié)果與討論

2.1 修飾Fe3+離子前后金粒子對DNA吸附量的變化規(guī)律

將修飾Fe3+離子前后金納米粒子對DNA吸附量的變化規(guī)律進行了對比，如圖1所示。在pH3.0－9.0的條件下，未修飾Fe3+離子的金納米粒子對DNA的吸附量始終在0.5 mg/mg左右，隨著pH條件變化不大。而對于Fe3+離子修飾的金粒子，其對DNA的吸附過程與未修飾Fe3+離子的粒子是完全不同的。在pH3.0時，修飾Fe3+離子的金納米粒子對DNA的吸附量達到1.96 mg/mg，要遠遠高于未修飾Fe3+離子的粒子對DNA的吸附量0.52 mg/mg。隨著pH升高到大于4.0時，修飾Fe3+離子的粒子對DNA的吸附量迅速下降，甚至低于未修飾Fe3+離子的粒子的吸附量0.4 mg/mg左右。當pH為9.0時，修飾Fe3+離子的金納米粒子對DNA的吸附量幾乎為零。修飾Fe3+離子的金納米粒子這種隨pH變化而產(chǎn)生的對DNA吸附量的差異是由Fe3+離子修飾到粒子表面上引起的。

圖1 螯合Fe3+離子前后的金納米粒子對DNA吸附能力隨pH條件的變化(DNA濃度為0.1 mg/ml)

圖2 螯合Fe3+離子前后的金納米粒子表面電位隨pH的變化

2.2 修飾Fe3+離子前后金納米粒子表面電位的變化規(guī)律

金納米粒子與DNA之間的作用通常被認為是靜電相互作用，主要是由粒子表面性質(zhì)決定的。我們對修飾Fe3+離子前后兩種粒子表面的Zeta電位進行了測量，來考察粒子表面電荷隨pH變化的規(guī)律。如圖2所示，隨著pH值升高，兩種粒子表面的電位都逐漸下降，未修飾Fe3+離子的粒子的電位從－1.81下降到－28.57 mV，修飾Fe3+離子的粒子表面電位從27.38下降到了8.11 mV。而兩種粒子對DNA的吸附量也隨著pH值升高而逐漸下降。對于未修飾Fe3+離子的粒子來說，粒子表面一直帶負電，由于靜電排斥作用，使DNA不能通過靜電作用被大量吸附到粒子表面。但是，粒子通過與DNA之間弱的氫鍵作用［24］及谷胱甘肽分子中含有的一部分NH3+的靜電作用而使粒子對DNA少量的吸附。在pH3.0時變化較大的原因是由于此時處在表面谷胱甘肽分子中的COO－的pK點附近，表面電荷變化較大。對于表面修飾了Fe3+離子的粒子，從pH3.0到9.0粒子表面一直帶正電，但是吸附效率卻變化明顯，當pH升高到大于4.0時，修飾Fe3+離子的粒子對DNA的吸附量迅速下降，甚至低于未修飾Fe3+離子的粒子。這說明兩種粒子對DNA的吸附機制完全不同，除了靜電作用外，一定存在另一種作用力使用DNA被吸附到粒子表面。

圖3 DNA及其在pH6.0和pH3.0條件下加入Fe3+離子后的紅外光譜

2.3 粒子表面Fe3+離子與DNA間配位作用的驗證

我們通過紅外測試來進一步理解粒子表面和DNA之間的相互作用，結(jié)果如圖3所示。在pH7.0條件下加入Fe3+離子后，紅外光譜與未加前比較，并沒有發(fā)生變化。當在pH3.0時的DNA溶液中加入Fe3+離子后，紅外光譜發(fā)生了明顯的變化。960 cm－1處的峰位代表的是磷酸根的對稱伸縮振動［25］，加入Fe3+離子后，此處峰消失。1 600－1740 cm－1代表了P－O伸縮振動和彎曲振動的合頻譜帶［25］，加入Fe3+離子后，此處峰位裂解為1 624和1 684 cm－1兩個峰。1 224 cm－1是P－O的伸縮振動吸收峰［25］，加入Fe3+離子后裂解為1 194和1 278 cm－1。這些數(shù)據(jù)變化說明磷酸根與Fe3+離子之間發(fā)生了配位相互作用。即DNA通過與Fe3+離子之間配位相互作用吸附到金納米粒子表面。

2.4 鹽濃度對吸附效率的影響

我們在確定Fe3+離子與磷酸根之間存在著配位相互作用后，又考察了在不同pH條件下鹽濃度變化對兩種粒子吸附DNA效率的影響。圖4為在兩個特定的pH值下(3.0和8.0)，不同粒子對DNA吸附過程中鹽濃度影響的比較。在具體的實驗中，每個反應的溶液溫度、DNA的初始濃度和加入硅粒子的濃度均保持一致。在pH3.0時，對于修飾了Fe3+離子的粒子來說，鹽濃度的變化并未對吸附效率產(chǎn)生影響，隨著鹽濃度的增加，粒子對DNA的吸附效率一直保持在98%以上，這說明鹽濃度的變化不會影響配位作用。而對于未修飾Fe3+離子的金納米粒子來說，當鹽濃度從0 mol/L增加到0.2 mol/L時，粒子對DNA的吸附率略有增加，從28%增加到32%。此時，粒子對DNA的吸附主要是由靜電吸引力或粒子表面同DNA分子間的氫鍵作用主導的，對鹽的敏感性不高。比較該pH條件下，兩種粒子的吸附效率隨鹽濃度的變化規(guī)律，可以看出，即使在較高的鹽濃度下，配位作用的吸附效率也要遠遠高于靜電作用。這說明，不論在低鹽度還是高鹽度下，利用配位作用吸附DNA都可以達到很高的吸附效率。

圖4 在pH 3.0和8.0條件下，粒子修飾Fe3+離子前后對DNA的吸附效率隨鹽濃度的變化

在pH8.0時，對于修飾了Fe3+離子的粒子，加入鹽后，其吸附效率從0.04%提高到了15%，但是仍然低于未修飾Fe3+離子的粒子。隨著鹽濃度的增加，吸附效率并沒有明顯提高。此時，粒子對DNA的吸附是由直接靜電力主導的，對鹽濃度不敏感。在此pH條件下對于未修飾Fe3+離子的粒子，其吸附DNA的效率從21.56%提高到了26.77%，提高的幅度不大。此時的吸附主要是靜電力或粒子表面同DNA分子間的氫鍵作用來主導的，對鹽濃度不敏感。

圖5 DNA在螯合Fe3+離子的金納米粒子表面的吸附機制

2.5 螯合Fe3+離子的金納米粒子對DNA的吸附機制

綜合前面的分析，我們總結(jié)出了修飾Fe3+離子的金納米粒子在pH3.0達到最高吸附效率時對DNA的吸附機制，如圖5所示。在pH3.0時，對于修飾Fe3+離子后的金納米粒子，配位作用在吸附過程中占據(jù)主導地位，吸附效率達到了98%以上，遠遠高于未修飾Fe3+離子的粒子的吸附率，并且不受鹽濃度的影響。

作為對比，還研究了表面修飾Ni2+離子的金納米粒子對DNA的吸附行為。圖6(A)對比了不同pH條件下，表面修飾Fe3+和Ni2+離子的粒子對DNA吸附量的變化規(guī)律。對于表面修飾Ni2+離子的粒子，在pH3.0時，粒子對DNA的吸附量達到了最大值0.61 mg/mg，但是遠遠低于同樣條件下修飾Fe3+離子的粒子對DNA的吸附量。隨著pH值升高，吸附量略有下降，但是下降程度並不大。

圖6 表面修飾不同離子的金粒子對DNA吸附量(A)和表面電位(B)隨pH變化的比較

在pH＜5.0時，表面修飾Fe3+的粒子對DNA的吸附量要遠高于Ni2+離子修飾的粒子。因為Ni2+離子(=2.1)［26］與磷酸根離子的結(jié)合能力要低于Fe3+離子(=8.3)［26］。因此，Ni2+離子與磷酸根離子之間的配位作用很弱，使得通過配位作用吸附到粒子表面的DNA的數(shù)量很少，因此Ni2+離子修飾的粒子不能通過配位相互作用實現(xiàn)對DNA的高效吸附。Ni2+修飾的粒子對DNA吸附的原理應該與未修飾的金納米粒子對DNA的吸附類似，是通過靜電作用或氫鍵相互作用實現(xiàn)對DNA的吸附，因此其吸附量要遠低于修飾Fe3+的粒子。當pH＞5.0時，表面修飾Ni2+離子的粒子對DNA的吸附量與pH＜5.0時差不多。因為Ni2+離子與氫氧根離子的作用不是很強(=4.9)［26］，仍然有部分Ni2+離子能夠與磷酸根離子發(fā)生配位相互作用，但是配位能力比較弱，因此只有少量DNA通過配位作用吸附到了粒子表面上。與表面未修飾金屬離子的粒子對DNA的吸附原理相似，粒子表面的NH3+與DNA的靜電作用及氫鍵作用使得Ni2+離子修飾的粒子對DNA的吸附量與pH＜5.0時差不多。但是要高于Fe3+離子修飾的粒子。我們比較了兩種金屬離子修飾的粒子的表面電位，如圖6(B)所示，表面電位的變化規(guī)律與前面未修飾金屬離子時的粒子一致，產(chǎn)生的原因也類似。

圖7 螯合Fe3+離子的金粒子對DNA的吸附(■)和脫附(□)能力隨pH值的變化

2.6 螯合Fe3+離子的金粒子對DNA吸附和脫附行為的變化規(guī)律

圖7給出了在pH3.0－9.0條件下Fe3+離子修飾的金納米粒子對DNA的吸附和脫附行為的變化規(guī)律。隨著pH值的升高，粒子對DNA的吸附量逐漸減少。在pH3.0時，粒子對DNA的吸附量達到最高值為1.93 mg/mg。當pH值下降到6.0時，DNA的吸附量下降到0.12 mg/mg，當pH升高到9.0時，吸附量幾乎為零，說明DNA幾乎不能吸附到粒子表面。我們又對pH3.0時已經(jīng)達到最大吸附DNA量的粒子進行脫附實驗。從圖7中可以看出，DNA的脫附曲線與吸附曲線幾乎呈現(xiàn)鏡像關系，當pH值從9.0下降到4.0時，脫附量從1.67 mg/mg下降到0.05 mg/mg。由此我們可以知道，對于Fe3+離子修飾的金納米粒子來說，最佳吸附點是pH3.0，最佳脫附點是pH9.0。

3 結(jié) 論

文章在谷胱甘肽功能化的金納米粒子表面螯合Fe3+離子后，研究了不同pH及鹽濃度條件下，粒子對DNA分子的吸附及脫附行為。經(jīng)過紫外、電位、紅外等測試手段論證了粒子在不同pH條件下對DNA分子的吸附機制及影響因素，并確定了最佳吸附條件。粒子表面修飾Fe3+離子后，在低pH(＜4.0)的條件下，通過Fe3+離子與DNA分子中磷酸根的配位相互作用，實現(xiàn)了粒子對DNA的高效吸附。這種吸附是不受溶液中的鹽濃度影響的。以這種配位作用為基礎的吸附效率要遠遠高于靜電作用。這種DNA與金屬離子的配位作用為高效提取DNA提供了一種新的技術。我們可以把一種能夠與磷酸根離子發(fā)生強配位作用的離子修飾到粒子表面，通過控制一定的pH條件，來排除溶液中氫氧根離子的干擾，以及一些非特異性的吸附［27］，以此來達到對DNA的高效特異性吸附［27］。這種方法也可以用于一些鹽橋法無法實現(xiàn)的實際應用中，比如從基因工程生產(chǎn)的多肽中去除去DNA雜質(zhì)而不引入額外的鹽。

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