付偉, 李彩霞, 劉文靜, 馬曉琴, 任亮, 黃林, 金素鈺, 鄭玉才

(1. 西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 成都 610041; 2. 西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院, 綿陽 621010)

利用雙向電泳-質(zhì)譜技術(shù)鑒定牦牛和犏牛睪丸中的差異表達(dá)蛋白質(zhì)

付偉1, 李彩霞1, 劉文靜2, 馬曉琴1, 任亮1, 黃林1, 金素鈺1, 鄭玉才1

(1. 西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 成都 610041; 2. 西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院, 綿陽 621010)

比較了牦牛和犏牛睪丸組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)差異; 應(yīng)用雙向電泳-質(zhì)譜技術(shù), 對牦牛和犏牛的睪丸組織中差異蛋白質(zhì)進(jìn)行分離和鑒定; 對獲得的22個差異表達(dá)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫搜索, 獲得了19個蛋白質(zhì), 其中有3種分子伴侶可能與犏牛雄性不育有關(guān); 研究結(jié)果表明, 牦牛和犏牛睪丸組織中存在差異表達(dá)蛋白, 并可利用雙向凝膠電泳進(jìn)行分離, 為進(jìn)一步分析犏牛雄性不育的原因提供了線索.

牦牛; 犏牛; 睪丸; 雙向電泳; 質(zhì)譜

牦牛主要分布于我國青藏高原地區(qū), 對惡劣環(huán)境有極強(qiáng)的適應(yīng)能力, 是青藏高原地區(qū)牧民的主要生活和生產(chǎn)資料. 將普通牛同牦牛雜交, 其后代犏牛具有生長速度快、產(chǎn)肉產(chǎn)奶量高等特點(diǎn). 然而, 由于物種間存在生殖隔離, 使得犏牛具有雄性不育的特點(diǎn), 這極大阻礙了犏牛優(yōu)良性狀的橫向遺傳和保留. 為解決這一難題, 國內(nèi)外牦牛研究者經(jīng)過大量科學(xué)研究, 不斷探索解決犏牛雄性不育的方法, 并已取得一定成果.

已有的研究主要涉及對犏牛的精子發(fā)生水平、生殖器官解剖和生殖內(nèi)分泌、生化遺傳學(xué)等方面研究[1]. 但迄今為止, 有關(guān)犏牛雄性不育的機(jī)制仍不清楚. 胡歐明等[2]對精子的發(fā)生進(jìn)行了研究, 發(fā)現(xiàn)犏牛精子發(fā)生存在各個時期的生殖細(xì)胞, 但從精母細(xì)胞細(xì)胞開始以后逐級受阻; Huang等[3]通過對牦牛及犏牛的乳酸脫氫酶C基因選擇性剪切變異體的定量分析發(fā)現(xiàn), 選擇性剪切在調(diào)控該基因在睪丸組織中的表達(dá)可能有一定影響, 可能與犏牛雄性不育有關(guān). 對SYCP3、Dmc1等基因的分析發(fā)現(xiàn), 犏牛與其他牛相比, 在轉(zhuǎn)錄、表達(dá)、修飾等環(huán)節(jié)存在一些差異, 可能與犏牛雄性不育有關(guān)[4-7]. 然而, 有關(guān)犏牛雄性不育的因果關(guān)系仍不清楚, 尤其缺乏蛋白質(zhì)水平的證據(jù).目前, 蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)應(yīng)用于植物雄性不育及醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)等領(lǐng)域[8]. 本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法, 分析牦牛和犏牛睪丸組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)差異, 探索犏牛雄性不育的可能機(jī)制. 將蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于犏牛雄性不育的研究尚未見報道.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

麥洼牦牛(Bos grunnies)和犏牛睪丸組織均采自成都市青白江一屠宰場. 選取健康的成年公牦牛(n=4)和公犏牛(n=2), 屠宰后立刻取其睪丸, 縱切面剖開后用干冰帶回實驗室, -80℃保存至分析.

1.2 主要試劑和儀器

固相pH梯度膠條(IPG strips, pH3～10, 非線性)、Bio-Lyte 3/10、丙磺酸(CHAPS)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、尿素均購自美國Bio-Rad公司; 苯甲基磺酰氟(PMSF)購自美國Amresco公

司; 硫脲購自Solarbio公司.

Protean IEF cell 等電聚焦系統(tǒng)、Protean II xi cell 垂直電泳槽、Versa Doc 1000凝膠成像系統(tǒng)及PDQuest Version 7.0.1軟件均為Bio-Rad公司產(chǎn)品; Biowave紫外可見分光光度計為英國Biochrom公司產(chǎn)品; CR21G高速冷凍離心機(jī)為日本日立公司產(chǎn)品; 超聲波破碎儀為美國Sonics公司產(chǎn)品.

1.3 睪丸組織總蛋白提取

從-80℃冰箱取出睪丸組織于冰上解凍, 分別稱取牦牛(n=4)和犏牛(n=2)睪丸各0.4 g, 分別加入5倍體積的樣品裂解液(7 mol/L尿素, 2 mol/L硫脲, 4%CHAPS, 65 mM DTT, 0.2% Bio-lyte, 1 mM PMSF), 用電動勻漿器在冰上勻漿, 并在冰浴下超聲破碎2 min, 然后4℃靜臵1 h; 裂解后的蛋白提取液在4℃下15000 g離心30 min, 取上清液分裝.

為去除蛋白溶液中的鹽類, 向上述上清液中加入4倍體積的預(yù)冷丙酮(含0.07%的β-巰基乙醇), 振蕩混勻, -20℃沉淀過夜, 然后15000 g于4℃離心30 min, 棄上清液, 加冷丙酮洗滌后同上離心10 min, 棄上清液, 室溫下干燥1 h. 向管中加入適量樣品裂解液溶解沉淀蛋白質(zhì)并分裝, 用改良的Bradford法測定蛋白濃度. 樣品-80℃保存?zhèn)溆?

1.4 睪丸組織蛋白的雙向電泳

等電聚焦采用固相pH梯度膠條, 每根膠條蛋白上樣1500 μg, 蛋白液和水化液共300 μl(7 mol/L尿素, 2 mol/L硫脲, 4%CHAPS, 65 mM DTT, 0.2% Bio-lyte, 0.001%溴酚藍(lán)), 采用膠條20℃主動泡脹14 h的方法上樣. 聚焦條件:恒溫20℃下, 250 V 3 h(慢), 500 V 1 h(慢), 1000 V 1 h(慢), 5000 V 3 h(快), 10000 V 60 kVh.

隨著社會的發(fā)展與進(jìn)步，證據(jù)的種類也在不斷發(fā)生變化，以往聞所未聞的電子郵件、短信、微信等，在信息化時代，經(jīng)過必要的手續(xù)或程序后，也已躋身證據(jù)“家族”，發(fā)揮著重要的作用。不過，由于法律最終調(diào)整的是人與人之間的關(guān)系，所以無論時勢如何變遷，相關(guān)的證人證言對于幾乎所有的案件來說，都是必不可少的，證人出庭作證就成為庭審中一個重要的環(huán)節(jié)。只有在對質(zhì)、質(zhì)證過程中，才能揭示和發(fā)現(xiàn)案件的真相，特別是當(dāng)一個人的證言對他人的定罪量刑起著關(guān)鍵作用的時候，更應(yīng)該在法庭上“當(dāng)面鑼、對面鼓”地碰撞一番，證言的真?zhèn)尾拍艿玫接行У罔b別。在港劇、美劇或英劇中，控辯雙方對證人的“交叉詢問”，往往會成為最精彩的片段。

等電聚焦結(jié)束后, 膠條進(jìn)行兩次平衡, 平衡緩沖液Ⅰ: 6 M 尿素, 2% SDS, 0.375 M pH8.8 Tris-HCl, 20%甘油, 2% DTT; 平衡緩沖液Ⅱ: 6 M 尿素, 2% SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH8.8, 20%甘油, 2.5%碘乙酰胺, 每次平衡15 min.然后用分離膠濃度為13%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離. 電泳開始16 mA/膠條電泳30 min, 然后恒壓200 V電泳直至溴酚藍(lán)指示劑距凝膠底部約1.0 cm處停止電泳. 用0.1%的考馬斯亮藍(lán)R-250染凝膠50 min,脫色后保存于7%的冰乙酸中.

1.5 凝膠圖像分析及蛋白質(zhì)斑點(diǎn)鑒定

利用凝膠成像系統(tǒng)獲取凝膠圖譜. 用PDQuest圖像分析軟件分析凝膠蛋白質(zhì)點(diǎn), 包括蛋白質(zhì)點(diǎn)的檢測、背景消減、匹配、點(diǎn)的強(qiáng)度比較等. 將3次重復(fù)試驗均有差異的蛋白點(diǎn)用滅菌槍頭挖出, 送深圳華大基因進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜鑒定.

2 結(jié)果

2.1 牦牛和犏牛睪丸總蛋白雙向電泳分析

利用雙向電泳對牦牛和犏牛睪丸組織提取的總蛋白進(jìn)行分離, 獲得了分辨率和重復(fù)性較好的電泳圖譜(圖1).經(jīng)PDQust凝膠分析軟件分析蛋白點(diǎn)差異, 牦牛和犏牛睪丸組織蛋白中分別有970±13個和959±16個點(diǎn)得到分離.在相同實驗體系下重復(fù)實驗3次獲得的凝膠圖譜經(jīng)軟件對其進(jìn)行背景消減后, 選取分離效果較好, 染色均勻, 拖尾較少, 斑點(diǎn)較多的蛋白質(zhì)圖譜作為參考膠, 對3次重復(fù)性實驗?zāi)z的蛋白點(diǎn)進(jìn)行匹配, 牦牛匹配點(diǎn)為837±12個,犏牛匹配點(diǎn)為805±14個, 匹配率分別為86%和84%. 隨機(jī)選擇3張凝膠圖譜, 選擇其上已匹配的50個蛋白點(diǎn), 對凝膠在IEF方向和SDS-PAGE方向上偏差進(jìn)行檢驗, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)同一樣本3塊凝膠蛋白質(zhì)點(diǎn)在位臵上有較好的重復(fù)性.

分析各種蛋白在牦牛和犏牛睪丸組織中的表達(dá)差異, 選取分別在3次重復(fù)試驗中均有2倍及以上差異的點(diǎn)作為差異點(diǎn), 結(jié)果共檢測到20個差異表達(dá)的蛋白點(diǎn), 鑒定得到了相應(yīng)的17種蛋白質(zhì). 其中, 在牦牛睪丸組織表達(dá)量高于犏牛的點(diǎn)有13個, 分別為A2、A17、A29、A40、A23、A14、A27、A34、A26、A38、A16、A19、A33; 在犏牛睪丸組織表達(dá)量高于牦牛的點(diǎn)有4個, 分別為B22、B19、B2、B24. 另外, 實驗還鑒定了在兩種牛睪丸組織中表達(dá)相似的2個蛋白點(diǎn), 分別為A11、A21.

圖1 牦牛(A)和犏牛(B)睪丸組織雙向電泳圖譜

2.2 牦牛和犏牛睪丸差異蛋白的鑒定

表1 牦牛和犏牛睪丸差異蛋白點(diǎn)的鑒定

3 討論

蛋白質(zhì)組學(xué)是后基因組時代的重要學(xué)科和研究手段. 利用雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜鑒定的方法, 研究人員已經(jīng)對睪丸組織蛋白質(zhì)組進(jìn)行了分析, 取得了十分有價值的資料[9-10]. 但對牦牛睪丸組織中蛋白質(zhì)組學(xué)方面還未見研究報道. 本實驗中分離并鑒定出了睪丸差異蛋白點(diǎn)19個, 其中在牦牛睪丸組織中高表達(dá)的蛋白點(diǎn)13個, 在犏牛睪丸組織中高表達(dá)的蛋白點(diǎn)4個, 在兩種牛睪丸組織中表達(dá)量相當(dāng)?shù)牡鞍c(diǎn)2個.

牦牛睪丸組織高表達(dá)的蛋白中, 鈣調(diào)蛋白(CaM)是一類介導(dǎo)調(diào)節(jié)Ca2+信號傳導(dǎo)途徑的信號分子, 該蛋白通過與Ca2+結(jié)合形成Ca2+-CaM復(fù)合物的形式調(diào)控其他蛋白酶活性, 進(jìn)而參與并調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、生長、分化及細(xì)胞凋亡等代謝活動, CaM還有助于有絲分裂過程中紡錘體和紡錘絲以及胞質(zhì)分裂的調(diào)節(jié)[11]; 線粒體過氧化還原酶-5即硫氧還蛋白還原酶(TrxR)有三種類型, TrxR1、TrxR2和TrxR3, 其中TrxR3特異性地存在于睪丸組織中,與雄性生育有關(guān)系[12]; L-天冬酰胺水解酶具有L-天冬酰胺酶和β-天冬氨酰肽酶活性, 在精子尾部中段表達(dá), 可作為精子的自身抗原[13].

研究發(fā)現(xiàn)3種在牦牛睪丸中高表達(dá)的分子伴侶. T-復(fù)合蛋白1(TCP 1)是TCP 1分子伴侶家族的一員, 可調(diào)節(jié)精子和卵細(xì)胞的融合過程[14]; 肽酰脯氨順-反異構(gòu)酶D(PPI)是一種廣泛存在于各種組織和器官的酶, 可催化肽酰脯氨基順反異構(gòu)化, 幫助寡肽及蛋白質(zhì)折疊, 對蛋白的合成、運(yùn)輸、修飾及對變性蛋白的清除等也有促進(jìn)作用[15];另外, PPI作為分子伴侶在熱休克蛋白Hsp70、Hsp90特異性識別等方面有重要作用[16], 因而有保護(hù)機(jī)體免受傷害和促進(jìn)細(xì)胞代謝的作用; 鐵蛋白是生物體內(nèi)儲存鐵的可溶性蛋白, 研究表明, 除了儲存鐵外, 鐵蛋白還是一種組蛋白分子伴侶, 參與了受精時染色質(zhì)的重建[17]; 上述3種蛋白均有分子伴侶活性, 且都在犏牛睪丸組織中表達(dá)偏低, 其表達(dá)量差異是否與犏牛雄性不育有關(guān)仍需進(jìn)一步研究.

值得指出的是, 在牦牛中高表達(dá)的另外1種蛋白與精子成熟有關(guān). 山梨醇脫氫酶(SDH1)是多元醇代謝通路的關(guān)鍵酶, 可將D-山梨醇氧化為D-果糖, 該通路作為能量來源, 在精子獲能和精子生理機(jī)能調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要作用; 研究還發(fā)現(xiàn)該蛋白的分泌受雄性激素調(diào)節(jié), 在附睪上皮細(xì)胞分泌的SDH1可從附睪液中運(yùn)輸?shù)鞍椎骄颖砻? 進(jìn)而修飾精子并使之成熟[18]. 精子成熟和獲能是卵細(xì)胞成功受精的基礎(chǔ), 上述蛋白在形成正常精子過程中占有缺一不可的地位, 其量在犏牛睪丸中非正常表達(dá)可能是導(dǎo)致犏牛雄性不育的原因之一.

犏牛睪丸組織高表達(dá)的蛋白點(diǎn)中, B19和B24均為血清白蛋白, Espinosa等[19]研究哺乳動物生精細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)血清白蛋白和β-雌二醇可作為正負(fù)調(diào)控因子調(diào)節(jié)電壓門控Ca2+通道, 但血清白蛋白過量表達(dá)是否對生精細(xì)胞有抑制作用還不得而知; 二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(DDAH)在動物體內(nèi)分為兩種類型: DDAH1型和DDAH2型,其中DDAH2型廣泛分布于睪丸和附睪中, 主要代謝非對稱性二甲精氨酸(ADMA)[20], ADMA可抑制內(nèi)皮型和神經(jīng)型一氧化氮合酶(NOS), 而NOS是機(jī)體內(nèi)催化一氧化氮(NO)生成最主要的酶, 它將L-精氨酸分解成NO和L-瓜氨酸[21]; NOS和NO參與了睪酮的分泌, 在生精過程、精子活力和活率、受精能力及精子脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等過程中起著重要調(diào)節(jié)作用; Valenti等[22]在研究NO濃度對小鼠睪酮分泌量的影響時發(fā)現(xiàn), 低濃度的NO可促進(jìn)小鼠睪酮分泌, 而高濃度NO則相反; Rosselli等[23]同樣提出過量的NO對精子有毒害作用, 影響其活力和活率, 增加不活動精子數(shù)量, 且精子受毒害程度與NO濃度成正比; 由此可見, 低濃度的NO對精子生成及成熟等有促進(jìn)作用, 而隨著濃度增加, 精子的活率反而下降, 可以推測犏牛睪丸組織中高表達(dá)的DDAH2將ADMA代謝之后,大量的NOS催化了NO的生成, 導(dǎo)致NO濃度過量, 嚴(yán)重影響了犏牛睪丸組織中精子發(fā)生、精子獲能、受精能力等, 這極可能是犏牛雄性不育的原因之一.

在兩種牛睪丸組織中表達(dá)量相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)中, 阿樸脂蛋白A-I是精子激活蛋白復(fù)合物(SPAP)的組成元件, 和免疫球蛋白的輕鏈及重鏈一起構(gòu)成了阿樸脂蛋白A-I-免疫球蛋白復(fù)合體, 該復(fù)合體可調(diào)節(jié)精子獲能, 是成功受精的基礎(chǔ)[24]; 同時, 阿樸脂蛋白A-I還特異性地與牛精清蛋白結(jié)合, 在調(diào)節(jié)精子生理活性等方面有特殊作用[25];磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白1(PEBP1)是一類約23KDa大小, 結(jié)構(gòu)高度保守, 生物學(xué)功能多樣的堿性蛋白質(zhì); PEBP1存在于哺乳動物的睪丸和附睪內(nèi), 主要分布于精子的頂體、后頂體區(qū)和鞭毛等部位, 在精子形成過程中參與精子膜的構(gòu)建; 作為去能因子受體, PEBP1與膜結(jié)合蛋白協(xié)同作用于精子頭部和鞭毛的膜, 促進(jìn)精子獲能[26].

綜上, 本實驗利用雙向電泳技術(shù)比較牦牛和犏牛睪丸組織中蛋白質(zhì)表達(dá)差異, 獲得了一批表達(dá)差異明顯的蛋白質(zhì). 根據(jù)這些蛋白質(zhì)的功能推測, 這些差異蛋白在牦牛生殖細(xì)胞發(fā)育與成熟等方面可能發(fā)揮重要作用.

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Identification of the differentially expressed testis proteins between yaks and cattle-yaks by two-dimensional electrophoresis combined with mass spectrometry

FU Wei1, LI Cai-xia1, LIU Wen-jing2, MA Xiao-qin1, REN Liang1, HUANG Lin1, JIN Su-yu1,
LIN Ya-qiu1, ZHENG Yu-cai1
(1. School of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.; 2. School of Life Science and Engineering, Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010, P.R.C.)

The objective of this study is to analyze the differently expressed testis proteins between yaks and cattle-yaks. Two-dimensional electrophoresis is used to isolate the proteins, and the differential protein spots are identified by mass spectrometry. Twenty-two differential proteins are successfully identified by mass spectrometry, and the corresponding nineteen proteins, including three chaperons which may relate to the male sterility of cattle-yaks, are obtained successfully. The present results show that two-dimensional electrophoresis combined with mass spectrometry can be used to analyze the expression difference of proteins between yak and cattle-yak testes, helping to elucidate the molecular mechanism of infertility in male cattle-yaks.

yak; cattle-yak; testis; two-dimensional electrophoresis; mass spectrometry

S823, S852.23

A

1003-4271(2014)01-0011-05

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.01.02

2013-10-16

鄭玉才(1965-), 男, 教授, 博士, E-mail: yucaizheng65@hotmail.com.

國家自然科學(xué)基金資助課題(No. 31240053); 中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)資助課題(No. 12NZYTH06); 西南民族大學(xué)研究生創(chuàng)新型科研項目資助(No. CX2013SZ52).