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（廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005）

鏈球菌性乳房炎LAMP可視化檢測方法的建立

賀婷，左宗輝，楊蓉，陳亞明，杜向宏，杜玉蘭，阮氏青海，趙熠珩，何寶祥

（廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005）

目的應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplifcation，LAMP）技術(shù)，建立一種簡便、快速檢測鏈球菌性乳房炎致病菌的方法。方法本研究根據(jù)鏈球菌屬細(xì)菌的特異性基因（tuf），設(shè)計(jì)一套LAMP引物，優(yōu)化反應(yīng)條件，進(jìn)行特異性和敏感性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果通過反應(yīng)條件優(yōu)化，該方法在水浴鍋中1 h內(nèi)即可完成全部反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果肉眼即可判定。對鏈球菌檢測的敏感性最高達(dá)到52 fg/μL，是普通PCR方法的10倍，且與其它常見乳房炎致病菌無交叉反應(yīng)。結(jié)論本研究成功建立了鏈球菌性乳房炎LAMP可視化檢測方法，該法特異、快速、靈敏，操作及結(jié)果判定簡便，設(shè)備要求低，適合基層獸醫(yī)臨床應(yīng)用。

鏈球菌；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；可視化檢測；乳房炎

奶牛乳房炎是一種嚴(yán)重制約奶牛養(yǎng)殖業(yè)、乳品加工業(yè)健康發(fā)展，危害公共衛(wèi)生安全及人類健康的疾病，有效預(yù)防和控制該病已成為國內(nèi)外關(guān)注的焦點(diǎn)。無乳鏈球菌（Sreptococcus agalactiae， Group B Sreptococcus，GBS）、停乳鏈球菌（Sreptococcus dysgalactiae subsp. Dysgalactiae，Group C Sreptococcus，GCS）及乳房鏈球菌（Sreptococcus uberis）是引起奶牛乳房炎的常見致病菌，因抗生素治療、產(chǎn)乳量下降以及對奶牛乳腺組織造成的不可逆損害，鏈球菌性乳房炎一直是奶牛業(yè)中高度流行、損失巨大的疾病[1]。盡管乳房鏈球菌及停乳鏈球菌被認(rèn)為是專性動物病原菌[2-3]，但無乳鏈球菌同時也能夠感染人類，引起嚴(yán)重的侵襲性新生兒感染，感染孕婦、老年人，導(dǎo)致免疫力低下的成年人死亡[4-5]。因此，保障奶品質(zhì)，嚴(yán)格控制鏈球菌性乳房炎的發(fā)生和流行，具有深遠(yuǎn)的經(jīng)濟(jì)影響與公共衛(wèi)生學(xué)意義。

致病菌檢測是乳房炎治療和控制方案的一個重要部分，及時、準(zhǔn)確地鑒別致病菌對治療有直接影響。如鏈球菌性乳房炎致病菌對青霉素、氨芐青霉素等抗生素均敏感，治療效果好[6]。因此，在臨床中準(zhǔn)確、快速的檢測出鏈球菌性乳房炎，有助于在早期及時采取防治措施、避免抗生素濫用，提高乳房炎治愈率。

在臨床實(shí)踐中，鏈球菌屬致病菌培養(yǎng)要求條件高、分離鑒定難度大、靈敏性低、耗時長；以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的多項(xiàng)檢測技術(shù)如普通 PCR[7]、實(shí)時定量PCR[8]、多重 PCR[9]，方法快捷、靈敏，準(zhǔn)確度較高。但是，這些現(xiàn)代檢測方法均需要復(fù)雜的儀器設(shè)備和技術(shù)要求，成本高，不適合臨床和基層現(xiàn)場檢測，難以推廣普及。

環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（loop mediated isothermal amp-lifcation，LAMP）是日本學(xué)者Notomi等于2000 年建立的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，在等溫條件下進(jìn)行的核酸變性和自動循環(huán)的鏈置換核酸擴(kuò)增反應(yīng)，其擴(kuò)增效率可達(dá)109～1010個拷貝數(shù)，且整個反應(yīng)在水浴鍋或恒溫金屬浴中完成[10]。該方法靈敏、特異、簡便、快速，結(jié)果判定方便、成本低廉，尤其適合在基層開展病原微生物的早期診斷和篩查。目前已在核酸研究，病毒、細(xì)菌及寄生蟲等微生物的診斷與預(yù)防、動物胚胎的性別鑒定，轉(zhuǎn)基因食品檢測和法醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[11]。

目前，國內(nèi)外尚未見到使用LAMP技術(shù)可視化檢測鏈球菌性乳房炎致病菌的報(bào)道。本研究針對鏈球菌屬致病菌的保守基因設(shè)計(jì)出一套通用LAMP引物，并在反應(yīng)前加入熒光染料鈣黃綠素和螯合劑Mn2+，根據(jù)反應(yīng)過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物與Mn2+結(jié)合后釋放出鈣黃綠素產(chǎn)生黃綠色熒光，從而可肉眼直接判讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這樣就不需要實(shí)驗(yàn)室特殊設(shè)備，在牛場等基層單位可直接利用該技術(shù)，為奶牛乳房炎的快速診斷提供了方法與參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 無乳鏈球菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和沙門氏菌為本實(shí)驗(yàn)室臨床分離鑒定保存；停乳鏈球菌臨床分離株由廣西大學(xué)基礎(chǔ)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室曾蕓老師惠贈；乳房鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、蠟樣芽胞桿菌和豬鏈球菌2型為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

1.1.2 試劑 Bst DNA Polymerase、10×Bst Buffer購自New England Biolabs公司；甜菜堿（Betaine）、鈣黃綠素（Calcein）購自Sigma公司；dNTP （10mM each）、DNA Marker、6×loading buffer購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；2×Taq MasterMix購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；MgSO4、MnCl2等其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 LAMP引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank公布的鏈球菌屬保守序列tuf基因（AY266996），使用在線軟件 Primer ExplorerV4（http∶//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/ index.html）設(shè)計(jì) LAMP 引物。引物由北京三博遠(yuǎn)志公司合成。

1.3 DNA模板制備

煮沸法制備DNA模板：取處于對數(shù)生長期的細(xì)菌純培養(yǎng)物1 mL，10000 r/min離心10 min，棄上清；加1 mL無菌生理鹽水重懸、洗滌菌體，離心10 min，棄上清；加入100μL TE溶液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8.0），懸浮沉淀，沸水浴20 min后，10000 r/min離心10 min，取上清液作為反應(yīng)模板，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 LAMP反應(yīng)的建立及條件優(yōu)化

配制的LAMP反應(yīng)體系為25μL，在經(jīng)典反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，對以下反應(yīng)條件進(jìn)行摸索：1～5 μL dNTPs（10 mmol/L each，終濃度為0.4 ～2.0 mmol/L）、0～3.0μL MgSO4（100 mmol/L，終濃度 為0～12 mmol/L）、0～6μL Betaine（5 mol/L，終濃度為0～1.2 mol/L）、0.25～1.25μL 內(nèi)引物（FIP 40μmol/L、BIP 40μmol/L，終濃度為FIP 0.4 ～2.4 μmol/L、BIP 0.4 ～2.4μmol/L）、1μL外引物（F3 5μmol/L、B3 5μmol/L，終濃度為F3 0.2μmol/L、B3 0.2μmol/L）、2.5μL10×Bst Buffer、1μL Bst DNA 聚合酶、1μL鈣黃綠素Calcein（625μmol/L，終濃度為25μmol/L）1μL MnCl2（12.5mmol/L，終濃度為0.5mmol/L）和2μL模板DNA，超純水補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)條件：溫度按56℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃依次遞增，反應(yīng)時間60 min，80℃ 5 min滅活終止反應(yīng)，按照上述反應(yīng)體系及條件分別進(jìn)行摸索優(yōu)化。反應(yīng)完成后取2μL擴(kuò)增產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳，多次重復(fù)試驗(yàn)后根據(jù)擴(kuò)增效果（有無特征性梯形條帶出現(xiàn)及條帶的亮度）進(jìn)行分析篩選，最終獲得最佳反應(yīng)體系和條件。

1.5 結(jié)果判定

由于在反應(yīng)之前已將熒光試劑（Calcein/ MnCl2）加入反應(yīng)體系，故在反應(yīng)結(jié)束后，肉眼在可見光或紫外光下直接觀察反應(yīng)液顏色變化，即可判定結(jié)果?；蛉?μL 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，70V 50 min后觀察結(jié)果。

1.6 特異性實(shí)驗(yàn)

按照優(yōu)化好的LAMP反應(yīng)體系，分別以無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、蠟樣芽胞桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌和白色念珠菌的粗提DNA為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，觀察反應(yīng)結(jié)果，驗(yàn)證方法特異性。

1.7 敏感性實(shí)驗(yàn)

將無乳鏈球菌DNA按10倍系列稀釋為52.6 ng/μL、5.26ng/μL、526pg/μL、52.6pg/μL、5.26 pg/μL、526fg/μL、52.6fg/μL、5.26fg/μL和0.526fg/μL，按照最佳反應(yīng)體系和最佳反應(yīng)條件進(jìn)行LAMP反應(yīng)，觀察擴(kuò)增結(jié)果，確定最低檢測限。

同時以常規(guī)PCR為對照，以相同的模板濃度進(jìn)行PCR擴(kuò)增（常規(guī)PCR擴(kuò)增上游引物F：ATGGTAGTTAAAGTTGGTATTAACG，下游引物R：TTATTTAGCGATTTTTGCAAAGTAC，目的基因?yàn)殒溓蚓鷮賕apC，1011 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳）。

2 結(jié)果

2.1 LAMP引物

通過在線引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)了一套鏈球菌屬特異性的LAMP引物，引物序列見表1。

表1乳房炎鏈球菌屬通用LAMP引物

2.2 反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

25μL LAMP反 應(yīng) 體 系：3μL dNTPs（10 mmol/L each， 終 濃 度 為 1.2 mmol/L）、2μL MgSO4（100 mmol/L，終濃度為8 mmol/L）、4 μL Betaine（5 mol/L，終濃度為0.8 mol/L）、0.75 μL 內(nèi)引物（FIP 40μmol/L、BIP 40μmol/L，終濃度為FIP 1.2μmol/L、BIP 1.2μmol/L）、1μL外引物（F3 5μmol/L、B3 5μmol/L，終濃度為F3 0.2μmol/L、B3 0.2μmol/L）、2.5μL 10×Bst Buffer、1μL Bst DNA 聚合酶、1μL鈣黃綠素Calcein（625μmol/L，終濃度為25μmol/L）1μL MnCl2（12.5 mmol/L，終濃度為0.5 mmol/L）和2 μL模板DNA，超純水補(bǔ)足至25μL。最佳反應(yīng)條件：63℃反應(yīng)60 min，80℃ 5 min滅活。

反應(yīng)完成后，可見光下直接用肉眼觀察反應(yīng)管，若顏色變?yōu)榫G色（翠綠色），為陽性反應(yīng)；若顏色不變?nèi)猿式奂t色，則為陰性反應(yīng)（見圖1-A）；紫外光下陽性反應(yīng)液發(fā)出綠色熒光，而陰性反應(yīng)液無明顯熒光（見圖1-B）。陽性反應(yīng)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，可觀察到LAMP反應(yīng)所特有的梯形條帶（見圖2）。

圖1敏感性實(shí)驗(yàn)可視化LAMP圖

2.3 特異性實(shí)驗(yàn)

圖2 LAMP反應(yīng)產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

結(jié)果顯示（圖3），只有鏈球菌屬菌（無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌）檢測結(jié)果為陽性，而對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、蠟樣芽胞桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌和白色念珠菌的檢測均為陰性。說明本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的LAMP通用引物具有極強(qiáng)的特異性。

圖3特異性實(shí)驗(yàn)可視化LAMP圖

2.4 敏感性實(shí)驗(yàn)

結(jié)果如圖1所示，所設(shè)計(jì)的LAMP特異性引物在最佳反應(yīng)條件下，對鏈球菌屬細(xì)菌DNA的最小檢出限為52.6 fg/μL。

常規(guī)PCR對照組2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果如圖4所示，得到PCR預(yù)期擴(kuò)增片段大約為1011bp，常規(guī)PCR方法最小檢測限為526 fg/μL。本實(shí)驗(yàn)建立的LAMP檢測方法敏感性比常規(guī)PCR高10倍。

3 討論

圖4敏感性實(shí)驗(yàn)普通PCR電泳圖

鏈球菌屬細(xì)菌是奶牛乳房炎的主要致病菌之一，對奶牛健康、奶品質(zhì)及產(chǎn)奶量等生產(chǎn)性能造成的影響巨大。同時，患病奶牛乳汁中含有大量體細(xì)胞等炎性因子、病原菌及其所產(chǎn)生的毒素等有害物質(zhì)，誤飲可直接危害人類健康，甚至誘發(fā)疾病。研究表明，鏈球菌性乳房炎致病菌對青霉素、氨芐青霉素、萬古霉素、氯霉素、利福昔明、阿莫西林-克拉維酸、頭孢唑林及頭孢哌酮均敏感，而對氨基糖苷類（鏈霉素，慶大霉素）、大環(huán)內(nèi)酯類（紅霉素）、林可酰胺類和四環(huán)素類抗生素存在耐藥性[6，12-13]。因此，及時、準(zhǔn)確的鑒別鏈球菌屬細(xì)菌，對鏈球菌性乳房炎的防控、減少抗生素濫用、公共衛(wèi)生安全等均具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)首次采用LAMP技術(shù)，針對鏈球菌屬保守基因（tuf）的6個特異區(qū)域設(shè)計(jì)了4條特異性引物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LAMP技術(shù)在恒溫條件下即可完成擴(kuò)增反應(yīng)，相較于傳統(tǒng)的PCR方法，已經(jīng)不再受昂貴儀器的限制；反應(yīng)時間短，1小時內(nèi)即可完成。敏感性與特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對于鏈球菌屬細(xì)菌的檢測，LAMP擴(kuò)增的敏感性是傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增技術(shù)的10倍，且特異性良好。

LAMP反應(yīng)可擴(kuò)增出大量的DNA，每50μL的反應(yīng)體系內(nèi)所擴(kuò)增出的DNA量超過45μg[14]。同時也會產(chǎn)生大量的反應(yīng)副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀，從而使反應(yīng)液呈白色渾濁，離心可見白色沉淀[10]。然而當(dāng)渾濁度較低時，肉眼不易察覺。故在反應(yīng)液中加入染料，既能夠提高LAMP反應(yīng)結(jié)果的可視化識別率，又無需電泳，能夠直接應(yīng)用于疫病的現(xiàn)場診斷，是最為簡單方便有效的結(jié)果判定方法之一。目前常見的方法是在反應(yīng)結(jié)束后開蓋加入SYBR Green I等熒光染料顯色，缺點(diǎn)是易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。原因有二：一方面，LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物量極大，開蓋操作、槍頭吸打液體引起反應(yīng)管內(nèi)空氣摩擦流動，極易形成氣溶膠污染實(shí)驗(yàn)環(huán)境。而氣溶膠一旦出現(xiàn)則難以消除，從而造成假陽性；二，SYBR Green I等染料同樣會與引物二聚體、氣溶膠污染的雙鏈DNA結(jié)合顯色，造成結(jié)果誤判。而使用Calcein/ MnCl2做熒光染料，不僅成本低，且只有在發(fā)生LAMP擴(kuò)增反應(yīng)時才會出現(xiàn)綠色（翠綠色），避免了假陽性干擾，降低了氣溶膠污染的產(chǎn)生，具有更好的特異性，實(shí)現(xiàn)反應(yīng)結(jié)果的可視化。因此，本實(shí)驗(yàn)在反應(yīng)前配制LAMP反應(yīng)液時就加入熒光試劑（Calcein/ MnCl2）。反應(yīng)前鈣黃綠素被Mn2+螯合，不發(fā)出熒光，反應(yīng)液顏色為桔紅色；隨著特異性擴(kuò)增反應(yīng)的發(fā)生，從dNTP解離出的焦磷酸根與Mn2+結(jié)合，釋放鈣黃綠素，發(fā)出熒光，且擴(kuò)增效率越高，熒光越強(qiáng)。此時，反應(yīng)液顏色為綠色（翠綠色）。

本研究建立了能可視化檢測鏈球菌性乳房炎通用LAMP檢測方法，具有快速、靈敏、特異、簡便、成本低廉等特點(diǎn)，對檢驗(yàn)人員和實(shí)驗(yàn)設(shè)備無特殊要求，且結(jié)果通過肉眼判斷即可。該技術(shù)有助于提高基層診斷實(shí)驗(yàn)室及獸醫(yī)單位鏈球菌屬致病菌的檢測能力，對鏈球菌性乳房炎的早期準(zhǔn)確診斷、防治有積極的意義，同時也為奶牛乳房炎快速診斷技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

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Development of a Loop-Mediated Isothermal Amplifcation Assay for Visual Detection of Streptococci from Bovine Mastitis

He Ting，Zuo Zonghui，Yang Rong，Chen Yaming，Du Xianghong，Du Yulan，Ruan Qinghai，Zhao Yiheng，He Baoxiang
（College of Animal Science and Technology，Guangxi University，Nanning 530005）

ObjectiveTo develop a loop-mediated isothermal amplifcation （LAMP） assay for rapid detecting Streptococci from bovine mastitis.MethodsA set of specifc primers were designed according to the tuf gene sequences published in GenBank for LAMP assay，the reaction parameters were optimized and then specifcity and sensitivity were tested.ResultsThe results could be observed within an hour after optimization of the reaction conditions. The detection limit of this LAMP assay was 52 fg/μL，10 times sensitive than routine PCR assay and had no cross reaction with other pathogens of mastitis.ConclusionThis LAMP assay was specifc and sensitive for visual detection of Streptococci from bovine mastitis without expensive equipment. The LAMP assay could be a good alternative method for feld specifc diagnosis of Streptococci in grassroots veterinary stations and farms.

Streptococci；loop-mediated isothermal amplifcation；visual detection；mastitis

S858.23

：A

：1005-944X（2014）04-0085-05

國家自然科學(xué)基金，項(xiàng)目批準(zhǔn)號：31260631；廣西高校教改項(xiàng)目編號：GXTSZY141

何寶祥