張 志，劉自立，董雅琴，于美芳，劉 爽，吳發(fā)興，邵衛(wèi)星，李曉成，王樹(shù)雙

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島 266032；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650201）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是一種以豬腹瀉、嘔吐和脫水為主要特征的急性高度接觸性腸道傳染病[1]，此病多發(fā)于冬季12月至來(lái)年2月寒冬季節(jié)，在夏季也可發(fā)生，尤其哺乳仔豬受害最嚴(yán)重。新生仔豬PED潛伏期為24～36小時(shí)。病豬表現(xiàn)嘔吐、腹瀉和脫水，年齡越小，癥狀越重，其病原是豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）。該病毒最早分離于比利時(shí)表現(xiàn)腹瀉的豬群，并命名為類冠狀病毒CV777株，而后英國(guó)、匈牙利、德國(guó)、加拿大、日本、韓國(guó)等相繼報(bào)道本病的發(fā)生[2]。我國(guó)自上世紀(jì)80年代初開(kāi)始陸續(xù)發(fā)生PED，特別是最近3年以來(lái)，PED已成為最重要的豬群疫病，不僅感染面廣，而且發(fā)病率和死亡率都居高不下，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-5]。鑒于PED和豬傳染性胃腸炎在臨床上很難區(qū)別，而且PEDV又難以在細(xì)胞上增殖和培養(yǎng)，所以，早期診斷對(duì)本病的防治具有極其重要的意義，因此建立一種快速，高靈敏度的診斷方法勢(shì)在必行。PEDV屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，病毒粒子核酸為線性正股單鏈RNA，整個(gè)基因組長(zhǎng)約28.6kb，含有4種結(jié)構(gòu)蛋白：S蛋白（spike protein）、sM蛋白（small membrane protein）、M蛋白（membrane protein）和N蛋白（nucleoprotein）。其中N基因?yàn)楹说鞍?，特性比較保守和穩(wěn)定，因此常作為檢測(cè)PEDV的候選基因區(qū)域。本文利用熒光定量PCR具有準(zhǔn)確定量、高敏感性和高特異性等優(yōu)點(diǎn)，針對(duì)PEDV比較保守的N基因區(qū)域設(shè)計(jì)了一個(gè)TaqMan探針，建立了一套快速檢測(cè)PEDV的熒光定量RT—PCR檢測(cè)方法，并在實(shí)際應(yīng)用中得以驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 病毒

豬流行性腹瀉病毒（DR13）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬傳染性胃腸炎（TGEV）均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 儀器與試劑

質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司，Trizol購(gòu)自invitrogen公司，pMD-18-T載體、One-step反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自法連寶生物工程有限公司。檢測(cè)用儀器主要有Bio-Rad熒光定量PCR儀和eppendorf核酸蛋白分析儀。

1.3 引物與探針

根據(jù)PEDV參考毒株JX088695的 N基因設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，目的片段 122bp。熒光探針序列為 PEDVP：5’-GTTGCCATTACCACGACTCCTGCTAC -3’（26846-26821），探針的5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為TAMRA，上游和下游引物分別為PEDV-F：5’-CTTCCCAGCGTAGTTGAGATTGT-3’（26760-26782） 和 PEDV-R：5’-TTGCCTCTGTTGTTACTTGGAGAT - 3’（26881-26858），引物和探針均由大連寶生物工程有限公司合成。

1.4 病毒RNA提取

按照Trizol說(shuō)明書從PEDV等病毒接種的細(xì)胞培養(yǎng)物或組織提取總RNA，于-70℃保存。

1.5 反應(yīng)體系

熒光RT—PCR的反應(yīng)采用一步法進(jìn)行，用矩陣法對(duì)熒光定量PCR的引物濃度、探針濃度進(jìn)行篩選優(yōu)化，以得到最佳的熒光定量PCR反應(yīng)條件。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)品制備

將PEDV目的片段克隆到pMD18-T載體轉(zhuǎn)化到DH5α中，搖菌提取質(zhì)粒，經(jīng)鑒定正確后，測(cè)定質(zhì)粒OD260值，并換算質(zhì)粒濃度（copies/μL），并放于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀釋，從10-1到10-9，以此作為模板在熒光定量PCR儀上檢測(cè)，得出各自的熒光曲線，儀器軟件自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 敏感性試驗(yàn)

將陽(yáng)性質(zhì)粒10倍梯度稀釋，從10-1到10-9，以此為模板進(jìn)行熒光定量PCR和常規(guī)RT—PCR檢測(cè)，比較二者將所能檢測(cè)出的最低拷貝數(shù)以確定熒光定量PCR的靈敏度。

1.9 特異性試驗(yàn)

分別提取CSFV、PRRSV、PCV2和TGEV的病毒核酸，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)，觀察PEDV熒光PCR是否可以同時(shí)檢測(cè)到其他病毒，以確定其特異性。

1.10 重復(fù)性試驗(yàn)

對(duì)來(lái)自貴州、四川的表現(xiàn)腹瀉癥狀的腸道組織樣和豬流行性腹瀉病毒細(xì)胞培養(yǎng)物分別用熒光定量RT—PCR方法進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)和批間重復(fù)性試驗(yàn)，批內(nèi)試驗(yàn)時(shí)每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，批間試驗(yàn)在第1，2和3天對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.11 樣品檢測(cè)

對(duì)河北、廣西、貴州、四川等地豬場(chǎng)送檢的糞便和腸道病料進(jìn)行處理，提取RNA，用建立的熒光定量RT—PCR進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)與常規(guī)PEDV 的RT—PCR方法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量RT—PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

綜合考慮反應(yīng)體積、反應(yīng)成本和反應(yīng)效率，最終將反應(yīng)體系定位25μL，其中含有2×1 step Buffer 12.5μL，引物各1μL，探針0.5μL，RNA模板 3μL，酶混合物（含反轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶）1μL，RNase-Free H2O 6μL。引物、探針終濃度為0.4μmol/L、0.2μmol/L。擴(kuò)增條件為：42℃反轉(zhuǎn)錄5 min；95℃預(yù)變性3 min；40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)（95℃15s、60℃ 30s）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

如圖1A所示，模板濃度為2.61×108、2.61×107、2.61×106、2.61×105、2.61×104、2.61×103、2.61×102、2.61×101拷貝 /μL 的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的熒光RT—PCR曲線。它們的循環(huán)閾值分別 為 14.65，16.31，19.17，22.14，26.56，30.17，33.23，35.27。將這些數(shù)據(jù)分析后生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，詳見(jiàn)圖1B，其中，y軸為循環(huán)閾值，x軸為質(zhì)粒樣品的拷貝數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.171，截距為43.450，R2為0.990，E=106.7%。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品的熒光RT—PCR動(dòng)力學(xué)擴(kuò)增和斜率曲線

2.3 敏感性試驗(yàn)

如表2所示，熒光定量RT—PCR能檢測(cè)出的模板最低濃度為2.61×101拷貝/μL，而常規(guī)RT—PCR（表1）的檢測(cè)極限是2.61×104拷貝/μL，這說(shuō)明熒光定量RT—PCR 的敏感性比常規(guī)RT—PCR 的敏感性高1000倍。

表1 熒光定量RT—PCR和普通RT—PCR的敏感性試驗(yàn)

2.4 特異性試驗(yàn)

分別用PEDV、CSFV、PRRSV、PCV2和TGEV等四種不同病毒分別提取核酸，并進(jìn)行熒光定量RT—PCR，結(jié)果只有PEDV呈現(xiàn)明顯的“S”形陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，其余病毒均未擴(kuò)增出（詳見(jiàn)圖2），表明建立的熒光定量RT—PCR試驗(yàn)方法具有良好的特異性。

圖2 PEDV熒光定量RT—PCR方法的特異性試驗(yàn)

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

為證實(shí)PEDV的穩(wěn)定性，對(duì)部分病料和疫苗分別進(jìn)行了3批批內(nèi)和批間的重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果表明（表2），批內(nèi)變異系數(shù)平均為0.84%±0.35，批間變異系數(shù)平均為1.55%±0.74，表明本檢測(cè)方法的重復(fù)性良好。

2.6 現(xiàn)地樣品檢測(cè)

對(duì)地方豬場(chǎng)送檢的43份糞便病料進(jìn)行了熒光定量RT—PCR檢測(cè)，同時(shí)與常規(guī)RT—PCR方法相比較，結(jié)果如表3。在43份待檢病料中，熒光定量RT—PCR方法檢出28份為陽(yáng)性，常規(guī)RT—PCR 方法檢出12份為陽(yáng)性，這表明熒光定量RT—PCR檢測(cè)的敏感性明顯高于常規(guī)RT—PCR方法。其中，河北、貴州等多省份送檢的病料中均可以檢測(cè)到PEDV，也進(jìn)一步說(shuō)明PEDV的感染面已經(jīng)非常廣泛。

表2 熒光定量RT—PCR方法的批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)

表3 現(xiàn)地樣品的熒光定量RT—PCR 和常規(guī) RT—PCR檢測(cè)

3 討論

熒光定量PCR是在PCR反應(yīng)過(guò)程中不斷連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)來(lái)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量，并以此來(lái)推斷目的基因的初始量，它綜合了PCR技術(shù)、激光技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)、數(shù)碼顯像技術(shù)等于一體，所以具有很高的靈敏度，逐漸成為動(dòng)物疫病檢測(cè)的必備方法。根據(jù)采用的熒光材料不同可以分為SYBR Green I染料法、TaqMan探針?lè)?、分子信?biāo)法等。SYBR Green I染料與任何雙鏈DNA都能結(jié)合，易產(chǎn)生非特異性熒光，而TaqMan探針?lè)▽?duì)目的序列有較高特異性且與分子信標(biāo)法相比設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，因此被普遍使用。

PEDV的多種檢測(cè)方法中，分子生物學(xué)方法已經(jīng)成為最常用的方法，陸續(xù)建立了一些PEDV的RT—PCR、套式RT—PCR、與TGEV和A型輪狀病毒等鑒別的多重RT—PCR等[6]。如Ishikawa[7]等根據(jù)S 基因序列設(shè)計(jì)了1對(duì)引物，成功地建立了診斷PEDV的RT—PCR方法。如Kubota 等[8]以M基因和N基因?yàn)榘谢蚪⒘薘T—PCR 方法來(lái)檢測(cè)PEDV。韓國(guó)人Kim O等[9]建立了TGEV和PEDV的二聯(lián)RT—PCR 診斷方法，可同時(shí)檢測(cè)出100 TCID50/mL的TGEV和PEDV。我國(guó)Zhao等[10]建立了可以同時(shí)鑒別PEDV、TGEV、PCV2和A型輪狀病毒的多重RT—PCR方法。但國(guó)內(nèi)外鮮有PEDV熒光定量RT—PCR檢測(cè)技術(shù)的報(bào)道。

本研究以N基因?yàn)榘谢虺晒⒘薖EDV的TaqMan探針熒光定量RT—PCR 檢測(cè)技術(shù)及時(shí)填補(bǔ)了這一病毒檢測(cè)技術(shù)的空白，本方法可應(yīng)用于細(xì)胞毒和現(xiàn)地病料中PEDV的檢測(cè)，在病毒隱性感染、發(fā)病豬早期快速確診和實(shí)時(shí)檢測(cè)等方面發(fā)揮重要作用，為PEDV 感染、增殖規(guī)律的研究及病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄過(guò)程的研究奠定了重要基礎(chǔ)。與常規(guī)RT—PCR相比，本方法的靈敏度更高，假陽(yáng)性率低，不易污染，且擴(kuò)增與檢測(cè)同步完成，不需要對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳，使得操作更加簡(jiǎn)便。

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