馮社軍，王慧娟，李軍濤，武艷強(qiáng)

（邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲056001）

隨著中國(guó)社會(huì)老齡化進(jìn)程的加劇，腦卒中發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)20年內(nèi)中國(guó)腦卒中的發(fā)病率平均以每年8．7%的速度增加［1，2］。小膠質(zhì)細(xì)胞（microglia，MG）作為腦神經(jīng)組織中固有的免疫細(xì)胞，其在腦卒中相關(guān)的炎癥反應(yīng)過程中扮演著重要的角色［3，4］。研究證實(shí)腦出血等狀態(tài)可直接導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化［4］。過度活化的小膠質(zhì)細(xì)胞隨即大量釋放NO、TNF－α和IL－6等炎癥介質(zhì)和部分神經(jīng)毒性物質(zhì)，直接導(dǎo)致神經(jīng)元壞死和誘導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡，同時(shí)還可使血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加導(dǎo)致腦水腫的發(fā)生［5，6］?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)該過程與核轉(zhuǎn)錄因子－κB（NF－κB）的活化密切相關(guān)［6～8］。同時(shí)大量研究表明他汀類藥物（如辛伐他汀和瑞舒伐他?。┛赏ㄟ^抑制NF－κB活化減輕炎癥反應(yīng)［9］。該實(shí)驗(yàn)的目的是探討瑞舒伐他汀能否通過抑制NF－κB活化下調(diào)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞TNF－α表達(dá)。

1 材料和方法

1．1 主要試劑和材料 PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程有限公司；瑞舒伐他汀購(gòu)買于英國(guó)阿斯利康公司；鼠抗人 TNF－α抗體、鼠抗人 NF－κB p65抗體，鼠抗人phospho－NF－κB p65抗體和鼠抗人β－actin抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；地高辛（美國(guó)Sigma公司），DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），小牛血清（杭州四季清），超純水，其余試劑均為分析純。

1．2 細(xì)胞培養(yǎng) 小膠質(zhì)BV2細(xì)胞常規(guī)接種在含10%胎牛血清、100g／L 青霉素、100g／L 鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37℃、95%空氣、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每48小時(shí)換液、傳代2次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。BV2細(xì)胞分為對(duì)照組（Control組）、LPS組和瑞舒伐他?。獿PS（Rosuvastatin＋LPS組，Ros＋LPS組）。其中對(duì)照組細(xì)胞加入PBS；LPS組和 Rosuvastatin＋LPS組加入 LPS（1μg／ml）；Rosuvastatin＋LPS組加入10μM的瑞舒伐他汀溶液進(jìn)行干預(yù)。

1．3 細(xì)胞TNF－αmRNA表達(dá)檢測(cè) 干預(yù)24h后，按照RT－PCR試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA。引物：TNF－α正義 5′－CGA GTG ACA AGCCTGTAG－3′，反義 5′－CCT TCTCCAGCTGGAGAGC－3′和 β－actin正義：5′－CTCCAT CCTGGCCT CGCTGT－3′，反義：5′－GCTGT CACCTTCACC GTTCC－3′。按照試劑盒說明書介紹進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)（Bio－rad）攝影，Quantity One軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行掃描分析。用與β－actin PCR產(chǎn)物條帶灰度比值作為TNF－αmRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1．4 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中TNF－α蛋白表達(dá)和NF－κB p65活化水平 干預(yù)24h后，按照試劑盒操作要求，首先提取細(xì)胞總蛋白，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE），然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1h，分別加入鼠抗人單克隆抗體TNF－α（1∶600）、phospho－NF－κB p65（1∶800）、NF－κB p65（1∶800）和β－actin（1∶2000），4℃孵育過夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶2000），用ECL進(jìn)行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 17．0進(jìn)行單因素方差分析，兩樣本均數(shù)多重比較采用LSD法，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 TNF－αmRNA和蛋白的表達(dá) 在干預(yù)24h后，對(duì)BV2細(xì)胞TNF－αmRNA和蛋白的表達(dá)水平使用RT－PCR法和 western blot法進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)與Control組相比較，BV2細(xì)胞在LPS干預(yù)后TNF－α mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0．05。但LPS組較 Ros＋LPS組 TNF－α mRNA和蛋白的表達(dá)升高更加顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0．05。見圖1、表1。

圖1 BV2細(xì)胞TNF－α表達(dá)的RT－PCR和western blot結(jié)果Figure 1 The RT－PCR and western blot results of TNF－αin BV2microglia

表1 BV2細(xì)胞TNF－αmRNA和蛋白的表達(dá)水平及NF－κB p65活化水平（n＝4，±s）Table 1 The mRNA and protein expression of TNF－α，and the activation of NF－κB p65in BV2microglia

表1 BV2細(xì)胞TNF－αmRNA和蛋白的表達(dá)水平及NF－κB p65活化水平（n＝4，±s）Table 1 The mRNA and protein expression of TNF－α，and the activation of NF－κB p65in BV2microglia

注：①與Control組相比較P＜0．05；②與LPS組相比較P＜0．05。

組別 TNF－α mRNA TNF－α蛋白Phospho－NF－κB p65／NF－κB p65 Control組0．21±0．4 0．23±0．02 0．14±0．03 Ros＋LPS組 0．59±0．22①② 0．61±0．15①② 0．47±0．14①②LPS組 0．94±0．06① 0．92±0．07① 0．86±0．07①

2．2 NF－κB p65活化水平 在干預(yù)24h后，對(duì) BV2細(xì)胞 NF－κB p65活化水平即 NF－κB p65磷酸化水平（Phospho－NF－κB p65／NF－κB p65比值）使用 western blot進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)與Control組相比較，BV2細(xì)胞在LPS干預(yù)后phospho－NF－κB p65／NF－κB p65比值明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。但LPS組較 Ros＋LPS組 phospho－NF－κB p65／NF－κB p65比值升高更加顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。見圖2、表1。

圖2 BV2細(xì)胞NF－κB p65活化的western blot結(jié)果Figure 2 The western blot results of the activation of NF－κB p65in BV2 microglia

3 討論

隨著社會(huì)老齡化加劇，動(dòng)脈粥樣硬化、原發(fā)性高血壓、糖尿病和心房顫動(dòng)等慢性疾病的患病持續(xù)增多，缺血性和出血性腦卒中發(fā)病率也明顯上升。在我國(guó)腦卒中每年新發(fā)病例約為150萬至200萬，且50%到70%腦卒中存活患者遺留有嚴(yán)重殘疾，進(jìn)一步加重疾病所導(dǎo)致的家庭和社會(huì)沉重負(fù)擔(dān)［1，2］。目前認(rèn)為急性腦梗死治療目的之一是改善缺血半暗帶潛在可挽救的缺血腦細(xì)胞，防止繼發(fā)性損害的產(chǎn)生［10］。急性腦梗死導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)可誘導(dǎo)大量的炎癥介質(zhì)釋放和腦血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的異常，進(jìn)一步導(dǎo)致血管通透性增加加重腦組織水腫，同時(shí)炎癥反應(yīng)又會(huì)進(jìn)一步加重腦卒中導(dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡等病理生理過程，形成惡性循環(huán)，故有效抑制腦卒中相關(guān)的炎癥反應(yīng)對(duì)保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞具有重要意義［3～7］。研究發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞（microglia，MG）作為腦神經(jīng)組織中固有的免疫細(xì)胞具有吞噬細(xì)胞的特征，其在腦卒中相關(guān)的炎癥反應(yīng)過程中扮演著重要的角色。小膠質(zhì)細(xì)胞分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的一員，數(shù)量約占神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞總數(shù)的5%到10%，其體積最小，在腦組織中廣泛分布，以海馬、嗅葉和基底神經(jīng)節(jié)處分布最為豐富，丘腦和下丘腦次之，腦干和小腦數(shù)量最少［11］。一般狀況下小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息和休眠狀態(tài)。當(dāng)腦卒中發(fā)生時(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞迅速活化，從靜止的分支樣轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨陌⒚装蜆拥男螒B(tài)，大量的表面分子迅速上調(diào)，包括CD14、MHC、趨化因子受體和其他一些活化標(biāo)記分子［12］。目前認(rèn)為小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的免疫活性細(xì)胞和最重要的抗原提呈細(xì)胞［3～7，11］。

目前大量的研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物如瑞舒伐他?。╮osuvastatin）和辛伐他?。╯imvastatin）等具有獨(dú)立于降脂以外的抗炎作用［9］。瑞舒伐他汀可以明顯抑制小鼠慢性哮喘導(dǎo)致氣道內(nèi)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的活化以及 TNF－α、IL－5和IL－13等炎癥介質(zhì)的釋放［9］。TNF－α作為體內(nèi)最重要的促炎癥介質(zhì)（pro－inflammatory mediator）在包括腦卒中在內(nèi)的多種炎癥性疾病中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用，神經(jīng)組織中TNF－α可直接和間接的誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，并促進(jìn)其吞噬功能，同時(shí)可促進(jìn)其他炎癥介質(zhì)的釋放和導(dǎo)致腦組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的增加［12］。多個(gè)研究表明抑制和下調(diào)TNF－α可以有效改善腦卒中導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，改善預(yù)后［12，13］。

非激活狀態(tài)下NF－κB以非磷酸化的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中；在炎癥和應(yīng)激等狀態(tài)下NF－κB迅速磷酸化，形成二聚體，并核轉(zhuǎn)位與具有κB結(jié)合序列的靶基因結(jié)合導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄活性的增加［14］。同時(shí)研究證實(shí)TNF－α轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)區(qū)存在κB結(jié)合序列，NF－κB是TNF－α最重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子之一［14］。另一方面研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物的抗炎作用與抑制NF－κB激活密切相關(guān)［14］。我們使用western blot法的結(jié)果表明瑞舒伐他汀可有效的抑制LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞NF－κB的活化水平。

4 結(jié)論

瑞舒伐他汀可能通過抑制NF－κB的活化下調(diào)了BV2細(xì)胞TNF－α的合成和釋放。我們的實(shí)驗(yàn)為瑞舒伐他汀用于改善腦卒中炎癥反應(yīng)和神經(jīng)保護(hù)的治療奠定了理論基礎(chǔ)，但仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)其在臨床中的價(jià)值和作用。

［1］ 馮社軍，趙 現(xiàn)，劉運(yùn)平，等．急性腦血管疾病并發(fā)感染的臨床分析［J］．西部醫(yī)學(xué)，2013，25（8）：1208－1209．

［2］ 馮社軍，趙 現(xiàn)，劉運(yùn)平，等．腦卒中復(fù)發(fā)影響因素的Cox回歸分析［J］．西部醫(yī)學(xué)，2013，25（6）：857－859．

［3］ 韓麗娟．小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)缺血性卒中后炎癥的機(jī)制研究進(jìn)展［J］．國(guó)際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志ISTIC，2012，39（4）．

［4］ 王 新，李明軍，張 坤，等．腦出血與小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥相關(guān)性［J］．中國(guó)老年學(xué)雜志，2013，33（013）：3268－3270．

［5］ Taylor RA，Sansing LH．Microglial responses after ischemic stroke and intracerebral hemorrhage［J］．Clin Dev Immunol，2013；2013：746068．

［6］ Zhou Y，Wang Y，Wang J，Anne Stetler R，Yang QW．Inflammation in intracerebral hemorrhage：from mechanisms to clinical translation［J］．Prog Neurobiol，2014；115：25－44．

［7］ Lin S，Yin Q，Zhong Q，et al．Heme activates TLR4－mediated inflammatory injury via MyD88／TRIF signaling pathway in intracerebral hemorrhage［J］．J Neuroinflammation，2012；9：46．

［8］ Uekawa K，Hasegawa Y，Ma M，et al．Rosuvastatin Ameliorates Early Brain Injury after Subarachnoid Hemorrhage via Suppression of Superoxide Formation and Nuclear Factor－Kappa B Activation in Rats［J］．J Stroke Cerebrovasc Dis［J］．2014．pii：S1052－3057（13）00508－9．

［9］ Zhu T，Zhang W，Wang DX，et al．Rosuvastatin attenuates mucus secretion in a murine model of chronic asthma by inhibiting the gamma－aminobutyric acid type A receptor［J］．Chin Med J（Engl），2012；125（8）：1457－1464．

［10］ 董 昕，王金林，譚小進(jìn)，等．氯吡格雷聯(lián)合氟伐他汀治療腦梗塞的臨床觀察［J］．西部醫(yī)學(xué)，2008，20（2）：322－324．

［11］ 賈 濟(jì)，劉愛秀，朱蕭玲，等．AM1241預(yù)處理對(duì)脂多糖所致小膠質(zhì)細(xì)胞活化及損傷的影響［J］．中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2011，10（6）：587－590．

［12］ 楊宏偉，韓紅星，謝琰臣，等．腫瘤壞死因子－αC863A，T1031C基因多態(tài)與缺血性腦卒中的相關(guān)性研究［J］．中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2010，9（9）：893－896．

［13］ 魯 銳，楊 平．參麥注射液對(duì)急性缺血性腦卒中患者血清TNF－α和IL－6的影響［J］．中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2013，11（11）：1399－1400．

［14］ Tao Zhu，Dao－xin Wang，Wei Zhang，et al．Andrographolide Protects Against LPS－induced Acute Lung Injury by Inactivation of NF－κB［J］．PLOS ONE，2013；8（2）：e56407．