裴利軍，姜 睿，粟宏偉，鄧青富，楊海帆，程 勇，朱永生

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科，四川 瀘州646000）

前列腺是男性重要的附屬性腺器官，其發(fā)生、發(fā)育及分泌功能均受雄激素的調(diào)控［1，2］。前列腺液約占精液的20%～40%［3］，性腺機(jī)能減退及老年相關(guān)性男性不育與前列腺液的分泌減少及理化性質(zhì)改變有關(guān)［4］。良性前列腺增生和前列腺癌等前列腺疾病的發(fā)生、發(fā)展均與雄激素關(guān)系密切。迄今為止，雄激素在生理和病理?xiàng)l件下對(duì)前列腺生長(zhǎng)發(fā)育及分泌的調(diào)控機(jī)制仍未完全闡明。水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）是一個(gè)膜通道蛋白家族，可促進(jìn)水和小分子物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，廣泛存在于人體各種組織器官，對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)外水平衡及細(xì)胞分泌功能具有重要作用［5］。本文通過(guò)免疫組化和免疫印跡方法研究AQP1、3和4在大鼠前列腺的表達(dá)，以及雄激素對(duì)其表達(dá)的影響，探討AQPs在前列腺中的功能，為研究前列腺疾病的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組及去勢(shì)大鼠模型制備 健康雄性8周齡SD大鼠30只，體重280～300g，由瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20℃～25℃，12h光照，晝夜交替，正常飲食，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組：A組（對(duì)照組，n＝10）、B組（去勢(shì)組，n＝10）、C組（去勢(shì)＋睪酮替代組，n＝10）。1%戊巴比妥鈉30mg／kg腹腔注射麻醉，取下腹正中切口，A組只切開(kāi)腹腔，不切除睪丸，B組和C組均切除雙側(cè)睪丸。術(shù)后第二天開(kāi)始，C組給予丙酸睪丸酮5mg／kg皮下注射，1次／d，對(duì)照組和去勢(shì)組給予等量生理鹽水注射，2周后尾靜脈取血測(cè)定血睪酮濃度。

1．2 主要試劑與儀器 兔抗大鼠 AQP1、AQP3、AQP4多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，全蛋白提取試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，DAB顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，ECL化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，丙酸睪丸酮購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。RM6280c型多通道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)為成都儀器廠(chǎng)生產(chǎn)，電泳槽和蛋白成像儀為美國(guó)Bio－Rad公司生產(chǎn)。

1．3 前列腺液的收集與標(biāo)本制備 前列腺液的收集采用Knee RA［6］所描述的方法。1%戊巴比妥鈉麻醉后，取下腹正中切口，顯露前列腺后外側(cè)盆神經(jīng)，連接RM6280c型多通道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)電極，調(diào)整參數(shù)為波幅0．8ms、頻率16Hz、電壓8～12v，給予持續(xù)脈沖式電刺激，可見(jiàn)大鼠陰莖充血并緩慢勃起，直到前列腺液噴出。為避免尿液污染前列腺液，電刺激前先用注射器抽空膀胱內(nèi)尿液。收集前列腺液并稱(chēng)重，切取腹側(cè)前列腺，剔除周?chē)Y(jié)締組織，稱(chēng)前列腺濕重并計(jì)算前列腺與體重比值，切除的標(biāo)本－70℃保存。

1．4 免疫組化檢測(cè)AQP1、3、4在大鼠前列腺的表達(dá)免疫組化采用SP法。4%多聚甲醛固定標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋，4μm 連續(xù)切片，梯度酒精脫蠟至水，10mmol／L檸檬酸緩沖液（pH 6．0）微波修復(fù)抗原3min，室溫冷卻，PBS漂洗，滴加1%BSA，室溫封閉2h，棄封閉液，滴加兔抗大鼠 AQP1（1∶100）、AQP3（1∶100）、AQP4（1∶100）抗體，置于濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜，PBS漂洗3次×5min，滴加0．3%H2O2，室溫15min，封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS漂洗3次×5min，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG，室溫孵育15min，PBS漂洗3次×5min，DAB顯色，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察染色強(qiáng)度，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，光鏡下觀(guān)察棕黃色顆粒為陽(yáng)性結(jié)果。

1．5 免疫印跡檢測(cè)大鼠前列腺AQP1、3、4的表達(dá)標(biāo)本剪碎液氮中研磨，加入預(yù)冷的組織裂解液（每1ml裂解液含磷酸酶抑制劑10μl，蛋白酶抑制劑5μl，100mmol／L PMSF 5？l），12000×g 4℃離心5min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度，加5×上樣緩沖液，100℃沸水中變性5min，自然冷卻。以40？g蛋白上樣，12%SDS－PAGE分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到0．2μm孔徑PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，加兔抗大鼠 AQP1（1∶1000）、AQP3（1∶1000）、AQP4（1∶2000）多克隆抗體孵育，4℃過(guò)夜，TBST洗膜3次×10min，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶5000）室溫孵育1h，TBST洗膜3次×10min，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液，Bio－Rad蛋白成像儀顯像。條帶灰度值采用Quantity One4．6．2軟件分析，以β－actin作為內(nèi)參。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 各組大鼠生理指標(biāo)比較 B組大鼠血睪酮水平［（13．07±1．83）nmol／L］較 A 組［（92．37±16．23）nmol／L］顯著減低（P＜0．05），C組血睪酮［（88．09±13．24）nmol／L］與A組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。B組前列腺液重量［（1．14±0．4）mg］較 A 組［（13．57±2．72）mg］顯著降低（P＜0．05），C組前列腺液重量［（14．43±2．87）mg］與A組比較無(wú)顯著差異。B組前列腺與體重比值（0．27±0．12）較 A 組（1．91±0．07）顯著降低（P＜0．05），C組前列腺與體重比值（1．85±0．10）與A組比較無(wú)顯著差異，見(jiàn)表1。

表1 各組生理指標(biāo)比較（±s）Table 1 Comparison of physiological index in each group

表1 各組生理指標(biāo)比較（±s）Table 1 Comparison of physiological index in each group

注：與A組比較，①P＜0．05

Group n Serum Level of testosterone（nmol／L）Weight of prostate fluid（mg）Ratio between prostate and body weight（mg／g×100%）A 10 92．37±16．23 13．57±2．72 1．91±0．07 B 10 13．07±1．83① 1．14±0．14① 0．27±0．12①C 10 88．09±13．24 14．43±2．87 1．85±0．10

2．2 AQP1、3和4在大鼠前列腺的表達(dá)定位 免疫組化結(jié)果顯示，AQP1主要在大鼠前列腺間質(zhì)的小動(dòng)脈、小靜脈壁表達(dá)，在前列腺腺泡上皮未見(jiàn)表達(dá)，見(jiàn)圖1。AQP3主要在前列腺腺泡上皮細(xì)胞膜表達(dá)，見(jiàn)圖2。AQP4則更多的在腺泡上皮靠近基底膜處表達(dá)，見(jiàn)圖3。形態(tài)學(xué)觀(guān)察可見(jiàn)B組前列腺的間質(zhì)出現(xiàn)萎縮，腺上皮層變薄。

圖1 AQP1在各組大鼠前列腺的表達(dá)（免疫組化×400）Figure 1 Expression of AQP1in prostate of each group （immunohistochemistry×400）

圖2 AQP3在各組大鼠前列腺的表達(dá)（免疫組化×400）Figure 2 Expression of AQP3in prostate of each group（immunohistochemistry×400）

圖3 AQP4在各組大鼠前列腺的表達(dá)（免疫組化×400）Figure 3 Expression of AQP4in prostate of each group（immunohistochemistry×400）

2．3 AQP1、3、4在大鼠前列腺的表達(dá)定量分析 免疫印跡結(jié)果顯示，B組AQP1蛋白表達(dá)較A組顯著降低（P＜0．05），C組與 A組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，B組AQP3的表達(dá)較A組顯著降低（P＜0．05），C組與A組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，各組中AQP4的表達(dá)無(wú)明顯變化（圖4），蛋白表達(dá)的相對(duì)灰度值，見(jiàn)表2。

3 討論

水的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)是維持細(xì)胞賴(lài)以生存的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素，近年研究顯示，大量水的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)依靠AQPs。迄今為止發(fā)現(xiàn)并成功克隆了13個(gè)水通道蛋白亞型，AQP0～12。其中AQP0、1、2、4、5、6和8對(duì)水具有通透性，AQP3、7、9和10對(duì)水和甘油具有通透性，AQP11和12具有與其它AQP亞型不同的原始結(jié)構(gòu)［7～9］。AQPs廣泛分布于人體多種組織器官中，特別是分泌功能旺盛的器官，在生理和多種病理情況下，AQPs均具有重要功能。據(jù)報(bào)道，在人類(lèi)腎臟集合管上皮細(xì)胞AQP2表達(dá)較豐富，可促進(jìn)腎小管對(duì)水的重吸收，在尿液濃縮過(guò)程中起重要作用［10］。AQP3基因敲除后的裸鼠，其皮膚表皮的水合作用明顯減低［11］，AQPs可引起顱腦損傷后腦水腫的發(fā) 生［12］。Park［13］發(fā) 現(xiàn) 在 雌 性 大 鼠 的 陰 道 壁 存 在A(yíng)QP1、2及3的表達(dá)，AQP1主要在陰道粘膜下層的毛細(xì)血管和小靜脈壁表達(dá)，AQP2、3主要在陰道粘膜上皮細(xì)胞表達(dá)，大鼠性喚起時(shí)AQP1、2的表達(dá)由細(xì)胞器膜向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移，表明AQP1、2在大鼠性喚起時(shí)可從陰道粘膜下小血管中轉(zhuǎn)運(yùn)大量液體到陰道，從而引起陰道潤(rùn)滑，并提出AQP2的表達(dá)受雌激素的調(diào)控。另有報(bào)道，高血糖可誘導(dǎo)雌性大鼠陰道壁中AQP1、2、3的低表達(dá)，是引起糖尿病大鼠陰道潤(rùn)滑下降的主要原因［14，15］。

表2 AQP1、3和4在各組前列腺的表達(dá)（與β－actin的相對(duì)灰度值，±s）Table 2 Expression of AQP1，3and 4in prostate of each group

表2 AQP1、3和4在各組前列腺的表達(dá)（與β－actin的相對(duì)灰度值，±s）Table 2 Expression of AQP1，3and 4in prostate of each group

注：與A組比較，①P＜0．05

Group n Relative greyvalue AQP1 AQP3 AP4 A 10 119．83±23．67 122．6±23．10 108．92±9．87 B 10 41．12±10．09① 71．8±10．08① 100．31±23．76 C 10 109．72±14．83 124．78±13．54 113．68±17．02

圖4 免疫印跡檢測(cè)AQP1、AQP3和AQP4在大鼠前列腺的表達(dá)Figure 4 Expression of AQP1，AQP3and AQP4in prostate of rats by Western Blotting

隨著對(duì)AQPs研究的深入，發(fā)現(xiàn)在男性生殖道中有多種AQP亞型的表達(dá)，其表達(dá)部位和功能具有組織特異性。例如在人類(lèi)輸精管上皮細(xì)胞膜的刷狀緣可見(jiàn)AQP1，2的表達(dá)。含有精子的睪丸液和附睪液從附睪管輸出后，近50%～90%的液體成分在輸精管中重吸收，從而使精子濃度急劇升高，推測(cè)AQP1、2參與了輸精管液體重吸收過(guò)程中［16，17］。AQP1在小鼠輸精管、精囊腺和前列腺中均有表達(dá)［18］，在人類(lèi)精囊腺內(nèi)皮細(xì)胞和前列腺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞也可檢測(cè)到AQP1的表達(dá)，但在附睪組織中未見(jiàn)表達(dá)，表明AQP1可能參與了精囊液和前列腺液的分泌［19］。Wang［20］等發(fā)現(xiàn)在人類(lèi)前列腺腺泡基底膜及中間層細(xì)胞中AQP3大量表達(dá)，這也是具有分泌功能的柱狀細(xì)胞含量最多的部位，而在間質(zhì)細(xì)胞無(wú)表達(dá)，表明AQP3也可能參與前列腺分泌功能。AQP9在人和大鼠附睪輸出管和輸精管上皮細(xì)胞腔面細(xì)胞膜表達(dá)豐富，有利于對(duì)輸精管內(nèi)液體成分的重吸收，增加精子濃度，同時(shí)也表達(dá)在前列腺上皮細(xì)胞膜，參與前列腺液的分泌，但在精囊腺中無(wú)表達(dá)，雄激素可誘導(dǎo)AQP9在前列腺的高表達(dá)［21］。這些研究表明AQPs在男性生殖道及附屬性腺中液體的重吸收和分泌具有重要作用。

4 結(jié)論

在大鼠前列腺中，AQP1、3和4均有表達(dá)，免疫組化顯示AQP1主要在前列腺間質(zhì)的小動(dòng)脈和小靜脈壁表達(dá)，而在具有分泌功能的前列腺腺泡上皮細(xì)胞未見(jiàn)表達(dá)，去勢(shì)大鼠前列腺間質(zhì)及上皮細(xì)胞出現(xiàn)不同程度萎縮，重量顯著減少，免疫印跡檢測(cè)AQP1表達(dá)顯著降低，推測(cè)AQP1可能與前列腺細(xì)胞代謝和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，對(duì)前列腺的生長(zhǎng)發(fā)育，維持正常的結(jié)構(gòu)具有重要作用。AQP3、4均在前列腺腺泡上皮豐富表達(dá)，但AQP3主要在上皮細(xì)胞膜表達(dá)，而AQP4更多地表達(dá)在靠近基底膜的腺上皮，AQP3、4可能均與前列腺分泌功能有關(guān)。去勢(shì)大鼠前列腺液分泌顯著減少，免疫印跡顯示AQP3表達(dá)顯著降低，而AQP4的表達(dá)未受影響，表明雄激素降低后前列腺液分泌減少與AQP3的表達(dá)降低有關(guān)，與AQP4無(wú)關(guān)。

［1］ Cunha GR，Alarid ET，Turner T，et al．Normal and abnormal development of the male urogenital tract．Role of androgens，mesenchymal－epithelial interactions，and growth factors［J］．J Androl，1992，13（6）：465－475．

［2］ Yuan TC，Veeramani S，Lin FF，et al．Androgen deprivation induces human prostate epithelial neuroendocrine differentiation of androgen－sensitive LNCaP cells［J］．Endocr Rela Cancer，2006，13（1）：151－167．

［3］ Ndovi TT，Parsons T，Choi L，et al．A new method to estimate quantitatively seminal vesicle and prostate gland contributions to ejaculate［J］．Br J Pharmacol，2007，63（4）：404－420．

［4］ Christensson A，Laurell CB，Lilja H．Enzymatic activity of proa－tate－specific antigen and its reactions with extracellular serine proteiase inhibitors［J］．Eur J Biochem，1990，194（3）：755－763．

［5］ Agre P，Sasaki S，Chrispeels MJ．Aquaporins：a family of water channel proteins［J］．Am J Physiol，1993，265（3Pt 2）：F461．

［6］ Knee RA，Hickey DK，Beagley KW．et al．Transport of IgG across the blood－luminal barrier of the male reproductive tract of the rat and the effect of estrodiol administration on reabsorption of fluid and IgG by the epididymal ducts［J］．Biol Reprod，2005，73（4）：688－694．

［7］ Agre P，King LS，Yasui M，et al．Aquaporin water channels－from atomic structure to clinical medicine［J］．J Physiol，2002，542（Pt 1）：3－16．

［8］ Ishibashi K，Sasaki S．The dichotomy of MIP family suggests two separate origins of water channels［J］．News Physiol Sci，1998，13（2）：137－142．

［9］ Gorelick DA，Praetorius J，Tsunenari T，et al．Aquaporin－11：a channel protein lacking apparent transport function expressed in brain［J］．BMC Biochem，2006，7（2）：14．

［10］ Nielson S，F(xiàn)rokiaer J，Marples D，et al．Aquaporins in the kidney：from molecules to medicine［J］．Physiol Rev，2002，82（1）：205－244．

［11］ Ma T，Hara M，Sougrat R，et al．Impaired stratum corneum hydration in mice lacking epidermal water channel aquaporin－3［J］．J Biol Chem，2002，277（19）：17147－17153．

［12］ Yu L，Yi J，Ye G，et al．Effects of curcumin on levels of nitric oxide synthase and AQP－4in a model of hypoxia－ischemic brain damage［J］．Brain Res，2012，1475（26）：88－95．

［13］ Park K，Han HJ，Kim SW，et al．Expression of aquaporin water channels in rat vagina：potential role in vaginal lubrication［J］．J Sex Med，2008，5（1）：77－82．

［14］ Lee HS，Li Z，Kim SO，et al．Effect of hyperglycemia on expression of aquaporins in the rat vagina［J］．Urology，2012，80（3）：737．e7－e12．

［15］ Pei L，Jiang J，Ouyang F，et al．Expression of aquaporins in vagian of diabetes mellitus rats［J］．J Sex Med，2013，10（2）：342－349．

［16］ Clulow J，Jones RC，Hansen LA，et al．Fluid and electrolyte reabsorbtion in the ductuli efferentes testis［J］．J Reprod Fertil，1998，53（Suppl）：1－14．

［17］ Stevens AL，Breton S，Gustafson，et al．Aquaporin 2is a vasopressinindependent，constitutive apical membrane protein in rat vas deferens［J］，Am J Physiol Cell Physiol，2000，278（4）：C791－C802．

［18］ Lu DY，Li Y，Bi ZW，et al．Expression and immunohistochemical localization of aquaporin－1in male reproductive organs of the mouse［J］．Anat Histol Embryol，2008，37（1）：1－8．

［19］ Mobasheri A，Marples D．Expression of the AQP－1water channel in normal human tissues：a semiquatitative study using tissue microarray technology［J］．Am J Physiol Cell Physiol，2004，286（3）：C529－C537．

［20］ Wang J，Tanji N，Kikugawa T，et al．Expression of aquaporin 3in the human prostate［J］．Int J Urol，2007，14（12）：1088－1092．

［21］ Wang J，Tanji N，Sasaki T，et al．Androgens upregulate aquaporin 9 expression in the prostate［J］．Int J Urol，2008，15（10）：936－941．