巨修練，錢 程

1.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430074；2.綠色化工過程教育部重點實驗室(武漢工程大學(xué))，湖北 武漢 430074

黃酮類化合物(如圖1)具有突出的抗焦慮效果，且不引起肌肉松弛、健忘等副作用.這些重大發(fā)現(xiàn)推動了對選擇抗焦慮，親和力高的配體研究.6-溴黃酮相對于黃酮對GABAA受體的苯二氮唑結(jié)合位點的親和力增加了近10倍[1].6-溴黃酮和GABAA的競爭結(jié)合參數(shù)是1.6～2.0(通過加入或不加入GABA時測量而得的6-溴黃酮和苯二氮唑結(jié)合位點的作用值比)，與地西泮很類似，具有完全激動劑的藥理學(xué)特征[2].當(dāng)引入硝基時甚至?xí)玫礁行У呐潴w，6，3’ -二硝基黃酮與苯二氮唑位點結(jié)合力更強，其Ki值取值范圍為17～50 nmol/L，它具有極有效的抗焦慮和肌肉松弛作用.6-溴-3’-硝基黃酮相對于雙硝基類似物，對GABAA受體苯二氮唑結(jié)合位點的親和力稍有增加，對苯二氮唑位點同樣具有選擇性[3].這類化合物的抗焦慮作用盡管比6，3’-二硝基黃酮稍差，但仍比地西泮的抗焦慮作用強.由于黃酮類化合物藥理學(xué)選擇性及其自身對GABAA受體苯二氮唑結(jié)合位點的活性低，使得對其衍生物的研究有了一個很大的飛躍，同時也對GABAA受體苯二氮唑結(jié)合位點選擇性有了新的認(rèn)識，促進(jìn)了黃酮類化合物的發(fā)展.

本研究采用海兔乙酰膽堿結(jié)合蛋白(2XYS)作為模板，對人α1β2γ2 GABAA受體進(jìn)行模建并能量優(yōu)化，利用分子對接進(jìn)一步指導(dǎo)研究.此外，從對接結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物的3’位對活性影響很大，且增多取代基團也會提高活性，進(jìn)而為更好的設(shè)計黃酮類化合物提供了理論依據(jù).

圖1 黃酮類化合物的基本結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of flavonoid

1 實驗部分

本研究的所有計算實驗都是通過SYBYL-X1.2軟件(Tripos Inc.)完成，若無特別介紹，參數(shù)均采用缺省值.

1.1 人α1β2γ2GABAA受體同源模建

1.1.1 同源模建簡介 大多數(shù)受體蛋白的三級結(jié)構(gòu)尚未解析，并且同源蛋白在進(jìn)化過程中保持著結(jié)構(gòu)保守性，利用同源蛋白作為模板來構(gòu)建受體蛋白是一種有效的方法[4].常用的軟件有兩類：一是利用蛋白質(zhì)分析軟件來預(yù)測，例如SWISS-MODEL主要用于預(yù)測蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，它通過同源建模的方法可對未知序列的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；另一類是對蛋白的結(jié)晶進(jìn)行X-衍射、核磁共振技術(shù)及冷凍電鏡等方法獲得結(jié)構(gòu)信息，將已知的蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)為模板，利用相關(guān)軟件構(gòu)建已知序列的蛋白高級結(jié)構(gòu)，例如SYBYL, Discovery Studio，Modeller都是比較常用的軟件 .

1.1.2 同源模建a.序列選擇 為了模建目標(biāo)受體人α1β2γ2GABAA受體，首先通過Swiss-Prot/TrEMBL數(shù)據(jù)庫篩選出合適的亞基序列：人α1亞基(蛋白質(zhì)序列號：P14867)，β2亞基(蛋白質(zhì)序列號：P47870)，γ2亞基 (蛋白質(zhì)序列號：P18507)，然后對以上3種亞基進(jìn)行編輯.考慮到所構(gòu)建的受體在跨膜區(qū)，所以刪去膜內(nèi)環(huán)區(qū)與膜外結(jié)合區(qū)域的氨基酸序列.

b.模板選擇 模板在同源模建中起關(guān)鍵作用，它直接影響靶結(jié)構(gòu)的質(zhì)量，并對結(jié)果起決定性作用[5].由于膜介蛋白晶體結(jié)構(gòu)較難獲得，且當(dāng)前結(jié)構(gòu)解析技術(shù)直接決定了膜介蛋白結(jié)構(gòu)的分辨率，因此已解析的三維結(jié)構(gòu)膜蛋白數(shù)目十分有限.本實驗中，采用海兔乙酰膽堿結(jié)合蛋白作為模板(PDB登記號2XYS，0.194 nm)[6].

c.構(gòu)建亞基 首先采用SYBYL-X1.2中的Biopolymer模塊中的compare sequences將靶標(biāo)序列與模板序列進(jìn)行比對(sequence alignment)，從而生成MSF (multiple sequence format)文件[7].然后再將Model Proteins中的ORCHESTRAR模塊中導(dǎo)入MSF文件，將模板結(jié)構(gòu)與靶序列的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對.最后構(gòu)建靶肽鏈的結(jié)構(gòu)，包括搜索環(huán)區(qū)，識別結(jié)構(gòu)保守區(qū)域(structure conserved regions，SCR)和添加側(cè)鏈.

d.模型組合 將人α1β2γ2受體與模板2XYS進(jìn)行比對，需要將前者的α1亞基β2亞基γ2亞基分別疊合到2XYS為模板的各個亞基上,以順時針方向(β2)(γ2)(α1)(β2)(γ2)構(gòu)建人α1β2γ2GABAA受體，如圖2所示.

圖2 人α1β2γ2 GABAA亞基對應(yīng)示意圖Fig.2 Subunit of human α1β2γ2 GABAA

e.模型的優(yōu)化與修正 因為只有運用分子動力學(xué)與分子力學(xué)的方法對受體進(jìn)行修正，才能驗證受體的可靠性.因此，本實驗選取立體場AMBER7 FF99[8]，運用共軛梯度法優(yōu)化體系能量梯度的RMS小于5 kcal/mol/nm，并通過分子動力學(xué)(molecular dynamic, MD)優(yōu)化模型，以檢驗?zāi)Ｐ偷姆€(wěn)定性.計算條件設(shè)置為300 K恒溫，每2.5 ps采樣一次軌跡數(shù)據(jù)，步長1 fs，計算總長為500 ps.

1.2 分子對接

1.2.1 對接方法 本實驗首先利用分子對接法將前面討論的黃酮類配體化合物與人α1β2γ2 GABAA受體蛋白對接.并結(jié)合打分函數(shù)，研究配體化合物與受體蛋白之間的相互作用，探究結(jié)合自由能與實測生物活性的線性關(guān)系，同時驗證模型的可靠性.

Surflex-docking[9]是SYBYL-X1.2中的一個模塊，可用于計算配體與受體之間的相互作用能，也可用于復(fù)合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化.本研究利用Surflex-docking進(jìn)行分子對接實驗. 因為受體的結(jié)合口袋直接影響分子對接結(jié)果，所以定義結(jié)合口袋具有十分重要的意義[10].前文中同源模建人的α1β2γ2GABAA亞型，選用共晶的6-氟-3’-硝基黃酮作為活性區(qū)域，利用殘基模式定義活性結(jié)合位點. Surflex-docking模塊中，原型分子(protomol)即我們所稱的活性位點.此外，bloat與threshold這兩個參數(shù)直接影響原型分子的大小與形狀. 其中，Bloat影響原型分子滲入蛋白空隙的程度，Threshold影響原型分子的大小[11].

1.2.2 對接配體分子 通過SYBYL-X1.2軟件中的dock ligand模塊，41種黃酮類化合物(如圖7)對接到模建的α1β2γ2GABAA受體中.

Surflex-docking進(jìn)行對接實驗后，分子配體的對接結(jié)果可通過Csorce模塊顯示.打分函數(shù)基于受體-配體復(fù)合物的結(jié)合親和力，將會考慮熵作用，極性作用，疏水作用，排斥作用，溶劑化作用.最后給出的總分即-lg10Kd，Kd為配體的解離常數(shù).可通過以下函數(shù)計算配體與受體的結(jié)合自由能(Free Energy of Binding, kcal/mol):

Free Energy of Binding=RTlnK[12-13]

2 結(jié)果和討論

2.1 同源模建

將海兔乙酰膽堿結(jié)合蛋白與α1β2γ2進(jìn)行序列比對，得到其同源性(Identity)分別為19.3%，19.6%和16.0%，由此可知：選取的2XYS作為人α1β2γ2亞基模型是比較合理的.將人α1β2γ2 GABAA受體與海兔乙酰膽堿結(jié)合蛋白進(jìn)行序列比對，如圖3所示.

圖3 人α1β2γ2GABAA受體與海兔乙酰膽堿結(jié)合蛋白序列比對圖Fig.3 Result of sequence alignment between human α1β2γ2GABAA and aplysia californica nAChR

經(jīng)過比對分子序列，搜索保守區(qū)域、構(gòu)建疏水環(huán)區(qū)、添加分子側(cè)鏈、分子動力學(xué)優(yōu)化后，得到人α1β2γ2 GABAA的二級結(jié)構(gòu)，如圖4所示.

圖4 人α1β2γ2GABAA受體二級示意圖Fig.4 Secondary structure of human α1β2γ2GABAA

人α1β2γ2GABAA受體需要進(jìn)行結(jié)構(gòu)修正和能量優(yōu)化.通過ProTable驗證受體模型的立體化學(xué)性質(zhì).人α1β2γ2GABAA的受體模型拉氏構(gòu)象圖如圖5所示.

從以上拉氏圖可知，大量的氨基酸殘基聚集在值為-150度與-40度處，人α1β2γ2 GABA A受體模型中有96.76%的氨基酸殘基處于允許區(qū)域，驗證了模型的合理性.因此，實驗中模建的人α1β2γ2 GABAA受體模型是可靠的，可用作分子對接實驗.

利用SYBYL-X1.2的Dynamics模塊進(jìn)行分子動力學(xué)模擬，人α1β2γ2 GABA A受體模型的動力學(xué)模擬能量-時間圖如圖6.經(jīng)過分子動力學(xué)能量優(yōu)化后，能量-時間圖里可知，α1β2γ2 GABA A受體模型在前300 ps能量變化較大，而后200 ps能量比較穩(wěn)定，通過分子動力學(xué)實驗，也說明了該模型是可靠的[14-15].

2.2 分子對接

本實驗利用分子對接法將黃酮類化合物與人α1β2γ2 GABAA受體進(jìn)行對接.通過上文軟件打分函數(shù)評價對接結(jié)果.

利用SYBY-X1.2軟件包中Surflex-docking模塊進(jìn)行分子對接以及氫鍵，通過分子對接和打分函數(shù)的方法對打分函數(shù)進(jìn)行評價，得到黃酮類化合物與人α1β2γ2 GABAA受體的對接得分，如表1所示.

表1 黃酮類化合物的對接得分Tabel 1 Docking result of Flavonoids

由于13號分子打分較高，且結(jié)構(gòu)相似性較高具有代表性，故對其與人α1β2γ2 GABAA受體對接圖(圖7)，進(jìn)行分析.

圖7 人α1β2γ2 GABAA受體與6-氟-3’-硝基黃酮對接圖Fig.7 Human α1β2γ2 GABAA docking with 6-fluoro-3’-nitro flavonoid

從上圖可知，13號分子3’位硝基的一個氧原子和氮原子作為氫鍵受體，與Arg97(精氨酸)側(cè)鏈上的亞胺上的氫原子形成氫鍵，為配體分子與受體結(jié)合提供了條件，同時也驗證了3’位對黃酮類化合物活性影響的重要性.而且從空間構(gòu)象來看，13號分子的母環(huán)與Tyr190(酪氨酸)和Tyr140(酪氨酸)的苯環(huán)形成共軛，這樣能使體系的能量降低，分子穩(wěn)定，也說明了所建模型的合理性.同時，從表1中可以發(fā)現(xiàn)，對比1號分子與9號分子，2號分子與10號分子，3號分子與11號分子，7號分子與13號分子可發(fā)現(xiàn)，當(dāng)6位所連基團相同時，將3’位的氫原子替換成硝基時，對接打分明顯提高.同理可看出，將3’位替換為其他大分子基團時，對接打分也有所提高.且大部分化合物的對接打分與實測活性一致，也驗證了模型的可靠性.綜上所述，黃酮類化合物3’位對活性影響很重要.同時，38號化合物的高得分，可能與較多的取代基提高了與結(jié)合口袋的結(jié)合能力有關(guān).

3 結(jié) 語

本研究通過同源模建人α1β2γ2 GABAA受體跨膜區(qū)的三維結(jié)構(gòu)，并結(jié)合分子動力學(xué)優(yōu)化和能量優(yōu)化，驗證了所建模型的穩(wěn)定性與可靠性.進(jìn)而將41個黃酮類衍生物與該模型進(jìn)行分子對接實驗，通過對接結(jié)果的分析，得知當(dāng)母環(huán)3’位被取代時，分子活性有所增加，其中被硝基取代時，活性提高較大.并從38號化合物中得到提示，相應(yīng)的增加取代基的個數(shù)，可能會提高活性，為設(shè)計黃酮類化合物提供了理論依據(jù).

致 謝

本實驗基于武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院提供的計算平臺，在此表示感謝！

[1] ARGYROPOULOS S V, NUTT D. The use of benzodiazepines in,anxiety and other disorders [J]. The journal of the European College of Neuropsychopharmacology, 1999, 9 (6): 407-412.

[2] VIOLA H, MARDER M, WOLFMAN C, et al. 6-Bromo-3’-nitroflavone, a new high affinity benzodiazepine receptor agonist recognizes two populations ofcentral cortical binding sites [J]. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 1997, 7 (3): 373-378.

[3] CRISTINA W, MARIEL M. Flavonoids as GABAA receptor ligands:the whole story[J]. Journal of Experimental Pharmacology, 2012, 4: 9-24.

[4] MARSHALL G R, MAYER D, NAYLOR C B, et al. Mechanism-based analysis of enzyme inhibitors of amide bond hydrolysis [J]. Progress in Clinical and biological research, 1989, 291: 287-295.

[5] ZHU Z Y, SALI A, BLUNDELL T L. A variable gap penalty function and feature weights for protein 3-D structure comparisons [J]. Protein Engineering, 1992, 5 (1): 43-51.

[6] BRAMS M, PANDYA A, KUZMIN D, et al. A structural and mutagenic blueprint for molecular recognition of strychnine and d-tubocurarine by different cys-loop receptors [J]. PloS Biology, 2011, 9 (3): 1100-1034.

[7] NEEDLEMAN S B，WUNSCH C D. A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins [J]. Journal of Molecular Biology, 1970, 48 (3): 443-453.

[8] WANG J M, WOLF R M, CALDWELL J W, et al. Development and testing of a general amber force field [J]. Journal of Computational Chemistry, 2004, 25 (9): 1157-1174.

[9] RUPPERT J, WELCH W, JAIN AN. Automatic identification and representation of protein binding sites for molecular docking [J]. Protein Science, 1997, 6 (3): 524-533.

[10] 巨修練，王黎麗，李科.斑馬魚A型γ-氨基丁酸受體同源模建及分子對接[J].武漢工程大學(xué)學(xué)報，2013(6)：20-29.

JU Xiu-lian, WANG Li-li, LI Ke. Homology modeling and docking of zebrafish γ-aminobutyric acid receptor [J]. Journal of Wuhan Institute of Technology, 2013 (6):20-29.(in Chinese)

[11] CRAMER R D, PATTERSON D E, BUNCE J D. Recent advances in comparative molecular field analysis (CoMFA) [J]. Progress in Clinical and Biological, 1989, 291: 161-165.

[12] CORRINGER P J, BAADEN M, BOCQUET N, et al. Atomic structure and dynamics of pentameric ligand-gated ion channels: new insight from bacterial homologues [J]. The Journal of Physiology, 2001, 588 (4): 565-572

[13] CHEN L G, DURKIN K A, CASIDA J E. Structure model for gamma-aminobutyric acid receptor noncompetitive antagonist binding: widely diverse structure fit the same site [J]. Proceedings of the National Academy of Science of the United Stated of America, 2006, 103 (13): 5185-5190.

[14] MITEVA M A, LEE W H, MONTES M O, et al. Fast structure-based virtual ligand screening combining FRED, DOCK, and Surflex [J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2005, 48 (19): 6012-6022.

[15] CHENG Jin, JU Xiu-lian, CHEN Xiang-yang, et al. Homology modeling of human α1β2γ2 and house fly β3 GABA receptor channels and Surflex-docking of fipronil [J]. Journal of Molecular Modeling, 2009, 15: 1145-1153.