何玉祥，孫 巖，劉振川，劉 洋，周 華，王茂華，袁 海，金 星，吳學(xué)君

大鼠骨髓基質(zhì)干細胞體外分離、純化、培養(yǎng)的實驗研究

何玉祥，孫 巖，劉振川，劉 洋，周 華，王茂華，袁 海，金 星，吳學(xué)君

目的探討Wistar大鼠骨髓基質(zhì)干細胞(BMSCs)體外分離、純化、培養(yǎng)的方法。方法 對5周齡Wistar大鼠予1%戊巴比妥鈉(0.006 ml/g)行腹腔麻醉，成功后于大鼠雙側(cè)后肢股骨、脛骨提取BMSCs，用貼壁培養(yǎng)法分離、純化、培養(yǎng)BMSCs，觀察細胞形態(tài)變化及繪制細胞生長曲線了解其生長、傳代、擴增特性，并應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞表面標(biāo)志物行細胞鑒定。結(jié)果 應(yīng)用貼壁培養(yǎng)法分離、純化、培養(yǎng)的大鼠BMSCs增殖迅速、生長曲線良好，經(jīng)細胞表面標(biāo)志物檢測證實為BMSCs，且細胞具有很好的均一性(96.36%)。結(jié)論 貼壁培養(yǎng)法能夠很好地分離、純化、培養(yǎng)大鼠BMSCs，并且獲得的細胞具有很強的增殖能力，取第3～6代細胞用于實驗研究最為合適。

骨髓基質(zhì)干細胞;分離和提純;細胞培養(yǎng)技術(shù);大鼠，Wistar

骨髓基質(zhì)干細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)屬成體干細胞(adult stem cells，ASCs)，在成體骨髓細胞中是除造血干細胞之外的另一類骨髓干細胞，為多能或全能干細胞，來源于中胚層的間充質(zhì)［1-2］。BMSCs是在胚胎發(fā)育過程中間充質(zhì)干細胞遷移填充組織間隙時定居骨髓腔而來，其主要存在于結(jié)締組織和器官組織通道中，骨髓是其主要來源。BMSCs在骨髓中的豐度并不高，并且在機體發(fā)育的不同階段含量也不同，年齡越大其含量越少。因此要能夠得到符合研究或臨床應(yīng)用數(shù)量的BMSCs，必須將體內(nèi)的BMSCs在離體條件下進行分離、純化、擴增，以獲得大量可用的細胞。本研究應(yīng)用BMSCs的底物黏附特性，用貼壁培養(yǎng)法分離、純化、培養(yǎng)獲得BMSCs，并觀察其形態(tài)及不同生長階段的生物學(xué)特點，為相關(guān)實驗研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性 Wistar大鼠，5周齡，體重130 g，由山東大學(xué)實驗動物中心提供［許可證號:scxk(16/10)20090001］。

1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清(FBS，Hyclone公司)，DMEM/F12培養(yǎng)液、HG-DMEM培養(yǎng)液及胰蛋白酶(Gibco公司)，D-Hank＇s液(自制)，青霉素和鏈霉素(Sigma公司)，流式細胞儀檢測所用抗體(大鼠 Anti-CD44-FITC標(biāo)記、大鼠 Anti-CD45-FITC標(biāo)記、大鼠 Anti-CD90-FITC標(biāo)記、大鼠 Anti-CD105-FITC標(biāo)記，BD公司);恒溫孵育箱(USA Forma Scientific)，倒置光學(xué)相差顯微鏡及PM-CBAD全自動顯微照相機(JAP，奧林巴斯)。

1.3 方法

1.3.1 BMSCs的分離和培養(yǎng):予0.006 ml/g 1%戊巴比妥鈉對大鼠行腹腔麻醉，75%乙醇浸泡雙側(cè)后肢消毒3 min。超凈工作臺無菌條件下，取大鼠雙側(cè)后肢股骨、脛骨，于無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)中去除附著組織，PBS反復(fù)沖洗干凈。剪開兩端骨骺處，用抽取10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液從一端正壓打入，將沖出的骨髓狀物滴入有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，小心多次將骨髓全部沖出，用尖頭吸管輕輕反復(fù)吹打制成細胞懸液。培養(yǎng)瓶擰緊瓶蓋后反向旋松瓶口，置于5%CO2、37℃、飽和濕度的孵育箱孵育。1 d后換掉部分培養(yǎng)液，3 d全部換掉，換液頻率為72 h。顯微鏡觀察細胞生長情況，融合度為80% ～90%時，用0.25%胰蛋白酶約1 ml室溫消化后，據(jù)細胞生長情況以1∶2或1∶3比例接種傳代，3～4 d換培養(yǎng)液1次。此時獲得細胞為第1代細胞(P1)，當(dāng)細胞生長至融合度達90%時，用上述方法再傳代，使細胞不斷純化和擴增。

1.3.2 BMSCs的傳代:鏡下觀察BMSCs鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底80% ～90%時，據(jù)其生長情況以1∶2或1∶3比例接種傳代。棄舊培養(yǎng)液。D-Hank＇s液輕緩漂洗細胞2次，盡量洗去殘余血清，棄 D-Hank＇s液。加0.25%胰蛋白酶(以蓋滿瓶底為準)輕輕晃動，于37℃下消化，倒置相差顯微鏡下觀察，細胞突起回縮、間隙增大、近乎縮成圓形時，吸出消化液。直接加10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化。彎頭吸管均勻有序吹打，動作不宜過猛，防止氣泡產(chǎn)生。調(diào)整懸液濃度，均勻加入至3個培養(yǎng)瓶中，1.0 ml/瓶，補充10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液至培養(yǎng)瓶容積1/10(約5 ml)，送孵育箱培養(yǎng)。

1.3.3 BMSCs生長曲線測定:取第3、6代BMSCs，棄上清。PBS沖洗3次，0.25%胰蛋白酶室溫消化。將所得單細胞懸液離心，1000 r/min，持續(xù)5 min，棄上清。細胞沉淀中加入10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，重新懸浮細胞。細胞計數(shù)板計數(shù)，使細胞濃度達1×104/ml，后以每孔1 ml接種于24孔板內(nèi)，孵育箱孵育培養(yǎng)。每日取3孔予0.25%胰蛋白酶消化后，計算細胞均數(shù)，持續(xù)測量10 d。以天數(shù)為橫坐標(biāo)，細胞數(shù)量平均值為縱坐標(biāo)，繪制細胞生長曲線。

1.3.4 BMSCs表面標(biāo)志物檢測:取第3代BMSCs，長滿培養(yǎng)瓶瓶底后，棄上清，PBS洗滌3次，0.25%胰蛋白酶消化貼壁細胞，將細胞懸液在室溫下800 r/min離心 3 min，棄上清。PBS洗滌 2次，800 r/min離心3 min，棄上清。加 PBS，制成1×106/ml細胞懸液。加入“1.2”項下抗體，用彎頭吸管吹打混勻，室溫孵育60 min。PBS洗滌1次，800 r/min離心3 min，棄上清。將細胞重新懸浮，流式細胞儀檢測細胞表面標(biāo)志物。同法做同型對照。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs形態(tài)學(xué)觀察 本方法所獲原始細胞液為多種骨髓細胞的混合液，細胞數(shù)量大，低倍光鏡觀察細胞形態(tài)呈球形，有折光性，各細胞間差別不大。培養(yǎng)1 d可見部分細胞貼壁生長，但培養(yǎng)液中可見大量小圓細胞懸浮，此時更換一部分培養(yǎng)液，去除一部分懸浮的非BMSCs。培養(yǎng)3 d，更換培養(yǎng)液，去除雜質(zhì)細胞。光鏡下可見:貼壁細胞呈單層生長，多數(shù)為單個散在分布或多個細胞聚集，分布不均;細胞大部分呈梭形，少部分呈多角形，細胞核居中，折光性強。培養(yǎng)1～5 d細胞為生長潛伏期，擴增較緩慢，細胞克隆數(shù)的增加不是特別顯著;培養(yǎng)6～8 d時觀察，發(fā)現(xiàn)此時細胞克隆數(shù)量增加顯著，外觀也開始出現(xiàn)明顯變化，呈紡錘形，有多個星形突起。細胞緊貼培養(yǎng)瓶壁生長延伸，呈條索狀融合，中心細胞輪廓不清，體積變小，而周邊細胞形態(tài)不變，呈漩渦樣生長。換液過程中，黏附于貼壁細胞上的雜質(zhì)細胞逐漸清除。培養(yǎng)10～14 d細胞長滿整個培養(yǎng)瓶底部，接近融合，細胞形態(tài)均一，呈片狀。若不進行傳代繼續(xù)培養(yǎng)，細胞可繼續(xù)增殖，每個集落數(shù)百至數(shù)千個細胞互相重疊形成雙層或多層。長滿瓶底后的細胞用0.25%胰蛋白酶37℃消化后，按1∶3的比例傳代。消化傳代后的細胞開始為圓形，懸浮或聚集分布，一般于18～24 h重新貼壁生長，變?yōu)槎趟笮位蚨嘟切?，此時細胞克隆速度急速增加，潛伏期較短(3 d左右)。然后步入快速增殖階段，7 d左右細胞重新長滿瓶底，接近融合，恢復(fù)片狀或輻射狀，細胞排列有一定的方向性。隨著傳代次數(shù)的增加，細胞不斷增殖和純化，傳到第10代以后，細胞形態(tài)發(fā)生較大變化，由梭形變肥大，細胞貼壁能力較差，細胞質(zhì)較疏松，增殖能力明顯下降。本組大鼠BMSCs培養(yǎng)鏡下形態(tài)學(xué)觀察見圖1。

2.2 BMSCs生長曲線測定 BMSCs有很強的增殖能力，原代細胞培養(yǎng)時潛伏期較長，一般5 d左右，隨后細胞克隆速度加快，細胞數(shù)量成倍增加，9～10 d進入增殖平臺期，細胞數(shù)量增加趨于平緩。傳代后增殖仍迅速，從圖2可看出，第3、6代細胞生長曲線相似，傳代后的BMSCs培養(yǎng)1 d時，BMSCs稍減少，為細胞適應(yīng)期，傳代后2 d進入生長潛伏期，第4天進入快速增殖期，集落中細胞呈對數(shù)增殖，7 d后進入增殖平臺期，細胞數(shù)量增加趨于平緩。

圖1 大鼠骨髓基質(zhì)干細胞培養(yǎng)鏡下形態(tài)學(xué)觀察

2.3 BMSCs表面標(biāo)志物鑒定 應(yīng)用流式細胞儀檢測結(jié)果顯示細胞均一性較好(96.36%)，細胞表面抗原CD44、CD90、CD105呈陽性，CD45呈陰性，證明培養(yǎng)的大鼠細胞為BMSCs，見圖3。

圖2 大鼠骨髓基質(zhì)干細胞第3、6代生長曲線圖P3代表第3代細胞，P6代表第6代細胞

圖3 流式細胞儀檢測大鼠骨髓基質(zhì)干細胞表面標(biāo)志物結(jié)果

3 討論

找到理想的種子細胞是組織工程的先決條件，該細胞在一定條件下體外培養(yǎng)能增殖發(fā)育成特定細胞、組織和器官，并能夠完全替代機體缺失區(qū)功能。理想的種子細胞應(yīng)具有以下特點［3-8］:①取材方便，對機體損傷小;②在體外培養(yǎng)過程中有較強的增殖傳代能力，生物活性好，衰亡率低，能夠在較短時間內(nèi)大量增殖并可定向分化;③具有修復(fù)功能，組織相容性好，免疫活性低，生物毒性低，安全性高。

BMSCs可在特定體內(nèi)微環(huán)境下被誘導(dǎo)分化為多種組織細胞，主要優(yōu)點為:①具有強大的增殖能力和多向分化潛能;②易于分離、純化、培養(yǎng)、擴增，不存在免疫排斥，多次傳代擴增和冷凍保存后仍具有干細胞特性;③BMSCs為成體干細胞，在應(yīng)用方面較少涉及倫理問題;④可轉(zhuǎn)染外源基因并穩(wěn)定高效表達。故BMSCs在組織器官再生、老化、功能衰退研究及先天性或遺傳性疾病治療等方面均有廣闊的發(fā)展空間，是目前公認最理想的細胞和基因治療工具。

BMSCs在骨髓中的含量為1/(105～106)個，且年齡越大在骨髓中的含量越少。在實驗和臨床研究中如何得到較高純度的BMSCs非常重要。目前，對BMSCs的獲取、分離、提純及體外擴增方法仍在不斷實驗和改進中，故尚無統(tǒng)一標(biāo)準［5，7，9］。1968 年，F(xiàn)riedenstein等利用自然貼壁法獲得了BMSCs，并證實了其存在［1］?，F(xiàn)在大多數(shù)研究者也都是應(yīng)用其貼壁性能而進行獲取、分離和體外培養(yǎng)。

目前，從骨髓中分離 BMSCs的主要方法［10-14］有:①貼壁法:骨髓中的造血干細胞能分泌生長因子和促貼壁物質(zhì)，有利于BMSCs的生長，同時可促進BMSCs貼壁。又因BMSCs具有黏附底物的特性，故應(yīng)用貼壁法分離BMSCs可以在換液、傳代中將不貼壁的造血干細胞等雜質(zhì)去除，使之純化。此法簡單、便捷，不影響細胞活性和增殖能力。本實驗即采用此法分離并進一步培養(yǎng)擴增，獲得較高純度的BMSCs。②密度梯度離心法:密度梯度離心法是根據(jù)骨髓中細胞成分比重的不同，經(jīng)高速離心將密度不等的細胞分離純化，應(yīng)用此法可提取到相對較純的BMSCs，但是存在細胞破壞多、增殖慢等問題［15］。③流式細胞儀分選法:骨髓中各種細胞大小不一，其細胞表面表達的特異性抗原也不相同，利用此特點可以分離得到相對高純度細胞。但該法極大地減弱細胞活性，有時可致細胞死亡，對細胞損傷極大。

本實驗所獲原始細胞液為多種骨髓細胞的混合液。細胞傳到第10代后，細胞形態(tài)發(fā)生較大變化，由梭形變肥大，細胞貼壁能力較差，細胞質(zhì)較疏松，增殖能力明顯下降，并出現(xiàn)返祖現(xiàn)象，呈成纖維細胞樣外觀。推測其原因可能是當(dāng)細胞離體培養(yǎng)后來自其他細胞的外源性信號被中斷，導(dǎo)致受其調(diào)控的增殖、分化表達減弱或停止。本實驗大鼠BMSCs生長曲線顯示，BMSCs具有很強的增殖能力，并經(jīng)歷了生長潛伏期、快速增殖期和增殖平臺期，傳代后增殖仍然迅速，說明在體內(nèi)豐度較低的BMSCs于體外進行培養(yǎng)、擴增是完全可行的。另外，圖2顯示，第3、6代細胞生長曲線基本相同，說明第3、6代細胞狀態(tài)較穩(wěn)定、最佳，取此細胞進行實驗比較合適。

對于BMSCs的培養(yǎng)液也在不斷改進中，不同成分的血清對BMSCs的成活率、黏附性、擴增能力以及多向分化的潛能影響較大。筆者所在科室發(fā)現(xiàn)應(yīng)用小牛血清后，分離培養(yǎng)的BMSCs黏附性較差，擴增能力也受影響且增殖較慢，而用FBS培養(yǎng)效果較理想，細胞生長好，貼壁能力強，增殖快速。因此，建議應(yīng)用10%FBS作為培養(yǎng)大鼠BMSCs的培養(yǎng)液。

總之，本研究利用貼壁培養(yǎng)法獲得BMSCs的方法是可行的，相比目前其他常用的分離方法(密度梯度離心法、流式細胞儀分選法)，在較高的細胞均一性和純度的基礎(chǔ)上，細胞成活率及增殖速度方面具有顯著優(yōu)勢，而且操作簡便、費用低;此法獲得的BMSCs具有很強的增殖能力，能夠滿足實驗研究的需要，取第3～6代細胞用作實驗研究較為合適。

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A Study on the Methods of Separation，Depuration and Cultivation in Vitro for Bone Marrow Stromal Cells of Rats

HE Yu-xiang1，SUN Yan1，LIU Zhen-chuan2，LIU Yang1，ZHOU Hua1，WANG Mao-hua1，YUAN Hai1，JIN Xing1，WU Xue-jun1(1.Departmentof Vascular Surgery，Provincial Hospital Affiliated to Shandong University，Jinan 250021，China;2.Department of Clinical Medicine，Shandong University，Jinan 250021，China)

ObjectiveTo explore themethods of separation，depuration and cultivation in vitro for bonemarrow stromal cells(BMSCs)of rats.MethodsFive-week-old Wistar ratswere anesthetized through abdominal cavities using 1%sodium pentobarbital(0.006ml/g)，and then BMSCswere extracted from the rats＇femurs and tibias.The adherent culturemethod was used to separate，purify and culture the BMSCs.The changes in cellmorphology were observed，and characteristics of cell growth，passage and amplification were studied by drawing curve of growth.The cellswere identified with flow cytometry.ResultsThe BMSCs obtained with adherent culture method had rapid proliferation and good growth curve，which proved BMSCs by the detection of cell surface marker，and the cells had good homogeneity(96.36%).ConclusionAdherent culture can well separate，purify and culture the BMSCs，and the obtained cells have better proliferative capacity，and the 3th-6thgenerations aremore suitable for experimental research.

Bonemarrow stromal cell;Isolation ＆ purification;Cell culture technique;Rat，Wistar

R394.26;R-332

A

2095-140X(2014)05-0010-04

10.3969/j.issn.2095-140X.2014.05.003

山東省自然科學(xué)基金(ZR2012HM063);高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金(20090131110059);山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎勵基金項目(2005BS03007)

250021濟南，山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院血管外科(何玉祥、孫巖、劉洋、周華、王茂華、袁海、金星、吳學(xué)君);250012濟南，山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系(劉振川)

吳學(xué)君，E-mail:drwuxuejun@yahoo.com.cn

2013-12-15 修回時間:2014-01-19)

基礎(chǔ)研究
·論著·