王霽翔 叢洪良

微小RNA（MicroRNA，miRNA）是高度保守的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸。它們以不完全互補(bǔ)的方式與成熟mRNA結(jié)合，抑制mRNA的翻譯或使mRNA降解，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，miRNA與心血管系統(tǒng)疾病有非常密切的關(guān)系，心臟疾病伴隨著miRNA表達(dá)譜的變化；改變細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的miRNA表達(dá)可以引起心肌梗死、肥大或心律失常等心臟疾病[1-2]。其中，miRNA-1被認(rèn)為具有心肌特異性，與心肌細(xì)胞的病理改變密切相關(guān)[3-4]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)研究miRNA-1水平與凋亡調(diào)控基因Bcl-2表達(dá)變化的關(guān)系，探討miRNA-1在心肌細(xì)胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 大鼠H9c2心肌細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司），轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、RNA提取試劑Trizol、逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、RNA酶抑制劑、real-time PCR試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司），miRNA-1 mimics和miRNA陰性對(duì)照片段由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成，Bcl-2抗體（ABCAM公司），β-actin抗體（Proteintech公司），F(xiàn)ITC Annexin V凋亡試劑盒（美國(guó)BD公司）。ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 大鼠H9c2心肌細(xì)胞株在含有10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。平均每3 d傳代1次。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到約70%融合時(shí)，換液備用。24 h后將細(xì)胞分為3組?？瞻讓?duì)照組：常規(guī)條件培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞；陰性對(duì)照組：根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑Lipo?fectamine 2000的操作說(shuō)明，轉(zhuǎn)染隨機(jī)合成的miRNA陰性對(duì)照片段；miRNA-1組：轉(zhuǎn)染miRNA-1 mimics片段的H9c2細(xì)胞。將溶于無(wú)血清DMEM中的miRNA-1 mimics與Lipo?fectamine 2000輕輕混合后室溫孵育20 min，然后將此混合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3 real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞miRNA-1水平 按照RNA提取試劑Trizol的說(shuō)明書進(jìn)行操作，提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度和純度，甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)，以U6作內(nèi)參。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃10 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)。目的基因的相對(duì)表達(dá)量根據(jù)公式2-△Ct計(jì)算得到（△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）。

1.4 細(xì)胞生存率檢測(cè) 轉(zhuǎn)染前1 d，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔板中，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，24 h后分別轉(zhuǎn)染miRNA-1 mimics和miRNA陰性對(duì)照片段，以不進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞作為空白對(duì)照，以只加培養(yǎng)液的孔作為調(diào)零孔。48 h后，向96孔板中的各組細(xì)胞中加入5 g/L的噻唑藍(lán)（MTT）20 μL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。吸凈各孔液體，加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，室溫下置于水平搖床上至結(jié)晶完全溶解。用酶標(biāo)儀檢測(cè)溶解液在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（A）值。以空白對(duì)照組的細(xì)胞生存率為100%，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生存率（%）=實(shí)驗(yàn)組A值/空白對(duì)照組A值×100%。

1.5 流式細(xì)胞儀雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按照1×105/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后按照上述分組情況給予相應(yīng)處理并繼續(xù)培養(yǎng)48 h。胰酶消化收集各組細(xì)胞，PBS洗滌2次，用binding buffer重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至流式專用管中，加入熒光標(biāo)記的AnnexinV和PI試劑各5 μL，室溫下避光孵育15 min，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 定量PCR和Western Blot檢測(cè)Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá) 按照1.3所述方法和公式提取細(xì)胞總RNA和計(jì)算目的基因Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量。目的基因?yàn)锽cl-2，擴(kuò)增長(zhǎng)度為120 bp，內(nèi)參基因?yàn)棣?actin，擴(kuò)增長(zhǎng)度為105 bp。PCR條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃15 s，退火60℃45 s，循環(huán)40次。

提取細(xì)胞總蛋白，BCA法定量。用蛋白溶解液調(diào)整蛋白濃度為5 g/L，取40 μg總蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），切取包含Bcl-2（25 ku）或β-actin（42 ku）的凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜后，用5%脫脂奶粉封閉NC膜2 h，加一抗Bcl-2（1∶500）或β-actin（1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次2 mL，洗滌5 min。加入二抗（1∶500）常溫孵育2 h。棄掉二抗，再次TBST洗膜3次，加入1 mL ECL發(fā)光液與膜充分接觸，于成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集。Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量為Bcl-2蛋白條帶與內(nèi)參β-actin蛋白條帶吸光度值的比值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料均以±s表示，多組間均值比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞中miRNA-1的水平 3組miRNA-1水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.73，P＜0.05）。miRNA-1組的miRNA-1相對(duì)表達(dá)量為3.46±1.28，明顯高于空白對(duì)照組的0.66±0.14和陰性對(duì)照組0.71±0.16（均P＜0.01）。

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存率 3組間細(xì)胞生存率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=69.60，P＜0.05）。miRNA-1組細(xì)胞生存率為45.69%±8.13%，明顯低于陰性對(duì)照組的97.87%±10.21%和空白對(duì)照組的100%± 8.61%（P＜0.01）。

2.3 流式細(xì)胞儀雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染miR?NA-1 mimics 48 h后，細(xì)胞凋亡率為15.7%±2.82%，明顯高于空白對(duì)照組（3.13%±0.45%）和陰性對(duì)照組（3.33%±0.70%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=54.06，P＜0.01），見圖1。

Figure 1 The result of apoptosis rate detected by FCM圖1 流式細(xì)胞儀雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

2.4 定量PCR和Western Blot檢測(cè)Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)結(jié)果 轉(zhuǎn)染miRNA-1 mimics 48 h后，大鼠心肌細(xì)胞凋亡抑制因子Bcl-2的mRNA表達(dá)水平（1.45±0.08）明顯低于空白對(duì)照組（2.38±0.13）和陰性對(duì)照組（2.39±0.15），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=57.80，P＜0.01）。而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Bcl-2的蛋白表達(dá)水平：空白對(duì)照組（0.95±0.05）和陰性對(duì)照組（0.94±0.11）比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，miRNA-1組（0.50±0.10）明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（F=23.76，P＜0.01），見圖2。

Figure 2 The expression levels of Bcl-2 protein in different groups圖2 各組Bcl-2蛋白表達(dá)情況

3 討論

miRNA在細(xì)胞發(fā)育的所有進(jìn)程中起關(guān)鍵性作用，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、衰老、死亡以及維持細(xì)胞的自我更新[5-6]。miRNA-1是近年來(lái)研究較多的與心臟疾病有關(guān)的microRNA[7-8]，包括miRNA-1-1和miRNA-1-2兩個(gè)成員，其基因長(zhǎng)度均為21 bp。miRNA-1只在心肌和骨骼肌中表達(dá)，被認(rèn)為具有肌細(xì)胞特異性，其表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄因子如血清反應(yīng)因子、肌細(xì)胞增強(qiáng)因子-2（Mef2）或MyoD和肌肉調(diào)節(jié)因子（MRFs）等的調(diào)節(jié)。miRNA-1與心肌細(xì)胞的病理狀態(tài)密切相關(guān)。Yang等[3]研究發(fā)現(xiàn)，冠脈疾病患者的心肌組織中miRNA-1水平升高，其通過(guò)抑制K+通道Kir2.1亞基的編碼基因KCNJ2和縫隙連接蛋白Cx43的編碼基因GJA1轉(zhuǎn)錄后水平使細(xì)胞膜去極化、傳導(dǎo)力降低，從而引起或加重心律失常的發(fā)生。Shan等[4]報(bào)道，缺血大鼠心肌組織高表達(dá)miRNA-1，caspase-3活性和線粒體膜電位均升高，細(xì)胞凋亡明顯，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)miRNA-1通過(guò)降低胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）的蛋白表達(dá)水平促進(jìn)了心肌細(xì)胞的凋亡，引起了上述變化。

miRNA-1的靶基因多數(shù)為與細(xì)胞凋亡和增殖有關(guān)的基因，如PTMA[9]、PNP[10-11]等。Bcl-2是一種原癌基因，是阻遏細(xì)胞凋亡的核心分子，可以維持線粒體跨膜電位，抑制線粒體細(xì)胞色素C的釋放，從而抑制下游caspase的激活，發(fā)揮抗凋亡作用。本研究結(jié)果表明，向心肌細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入miRNA-1片段使心肌細(xì)胞高表達(dá)miRNA-1后，心肌細(xì)胞凋亡率升高，Bcl-2的表達(dá)水平降低。miRNA-1不僅作用于Bcl-2的轉(zhuǎn)錄后水平，也抑制了Bcl-2的轉(zhuǎn)錄水平，通過(guò)降低Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)促進(jìn)了心肌細(xì)胞的凋亡。

已有研究報(bào)道，拮抗一個(gè)miRNA有望糾正心力衰竭時(shí)的不良信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，具有成為預(yù)防和治療靶標(biāo)的潛能[12]。本研究進(jìn)一步闡明了miRNA-1在心肌細(xì)胞凋亡中的作用，為miRNA-1的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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