葉立紅 王翀奎 陳秀麗 楊 莉 戴二黑△

近年來(lái)，Hezode等[1]和Teixeira-Clerc等[2]先后發(fā)現(xiàn)大麻素及其受體在慢性肝病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著非常獨(dú)特的作用，尤其大麻素受體(cannabinoid re?ceptor,CB)1在肝纖維化方面的研究逐漸受到重視。為了更深入研究CB1在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制，本研究通過(guò)建立四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的C57小鼠肝纖維化模型，觀察肝組織中CB1和肝纖維化特異性標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）表達(dá)變化，以及CB1拮抗劑利莫那班對(duì)CB1及α-SMA表達(dá)的影響，為今后以CB1為靶點(diǎn)進(jìn)行抗肝纖維化治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。C57小黑鼠，雄性，無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)，33只，體質(zhì)量（20±3）g,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼料購(gòu)自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，合格證號(hào)：0029674。實(shí)驗(yàn)期間自由飲水和進(jìn)食。（2）主要試劑及儀器。日本OLYMPUS雙目顯微鏡，法國(guó)JOUAN MR型超低溫冰箱，北京中科恒信彩色病理圖文報(bào)告分析系統(tǒng)。CB1單克隆抗體、利莫那班購(gòu)自美國(guó)Cayman Chemical公司，α-SMA單克隆抗體購(gòu)自香港abcam公司，PV-6000免疫組化試劑盒及DAB顯色液均購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司。CCl4購(gòu)自天津市標(biāo)準(zhǔn)件科技有限公司，橄欖油購(gòu)自上海晶純?cè)噭┯邢薰尽?/p>

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及造模 正式實(shí)驗(yàn)前選取3只小鼠進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)造模2周，2周后處死經(jīng)病理證實(shí)纖維化模型成功。其余30只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組及利莫那班組，每組10只。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后每周一、四給予正常對(duì)照組腹腔注射橄欖油，橄欖油用量按0.01 mL/g體質(zhì)量，模型對(duì)照組、利莫那班組腹腔注射10% CCl4造模，10%CCl4用量按0.01 mL/g體質(zhì)量。每次腹腔注射前均檢測(cè)體質(zhì)量，調(diào)整注射劑量。造模2周后，于繼續(xù)造模的同時(shí)，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組生理鹽水灌胃0.2 mL/次,1次/d，利莫那班組利莫那班灌胃10 mg/kg，1次/d[3],再連續(xù)實(shí)驗(yàn)6周，其中模型對(duì)照組和利莫那班組在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各死亡1只。

1.2.2 肝組織標(biāo)本的收集與處理 各組小鼠分別在造模的第8周最后一次腹腔注射用藥后4 h，稱(chēng)質(zhì)量后4%水合氯醛腹腔注射麻醉處死，經(jīng)下腔靜脈無(wú)菌采血，并取出肝臟經(jīng)冷生理鹽水灌注沖洗殘血后,切取部分肝組織放入10%福爾馬林固定液中保存，用于病理診斷及免疫組化檢測(cè)，其余肝臟組織放入EP管中迅速置液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 病理學(xué)檢測(cè) 所有肝臟標(biāo)本均在10%福爾馬林中固定96 h，依次用75%、80%、95%、100%乙醇進(jìn)行梯度脫水，二甲苯透明，組織浸蠟，石蠟包埋。常規(guī)病理切片，切片厚度為4 μm，分別進(jìn)行HE和Masson三色染色，中性樹(shù)膠封片。光鏡下觀察肝組織形態(tài)學(xué)改變，并進(jìn)行小鼠肝組織纖維化評(píng)分[4]。

1.2.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 采用SP法檢測(cè)肝組織中CB1和 α-SMA表達(dá)，已知陽(yáng)性片為陽(yáng)性對(duì)照，PBS緩沖液代替一抗為陰性對(duì)照，并進(jìn)行半定量評(píng)分[5]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，同一指標(biāo)的組間比較采用單因素方差分析，分析前進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時(shí)用LSD法，若方差不齊則用Tamhane’s T2法，兩指標(biāo)間的相關(guān)性采用直線(xiàn)相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模6周時(shí)各組肝組織形態(tài)學(xué)改變 正常對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝板以小葉中央靜脈（CLV）為中心呈放射狀排列，匯管區(qū)(P)僅見(jiàn)極少量膠原纖維，CLV周?chē)匆?jiàn)膠原纖維。模型對(duì)照組CLV之間、CLV和P之間纖維間隔形成，部分區(qū)域纖維間隔較寬伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂，但未形成典型假小葉。利莫那班組肝臟CLV周?chē)梢?jiàn)少量膠原纖維沉積，匯管區(qū)纖維組織呈星芒狀增生。

2.2 CB1和α-SMA在肝組織中的表達(dá)及定位情況 CB1主要表達(dá)于肝細(xì)胞漿和肝竇內(nèi)肝星狀細(xì)胞（HSC）中，另外在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和匯管區(qū)及纖維間隔的肌成纖維母細(xì)胞也有陽(yáng)性表達(dá)。正常對(duì)照組CB1陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞較少，僅3例在肝細(xì)胞及HSC少量表達(dá)；模型對(duì)照組可見(jiàn)大量陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，且隨著壞死及纖維組織增生程度的加重，CB1陽(yáng)性表達(dá)量也逐漸增加；利莫那班組也可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)，但陽(yáng)性細(xì)胞較模型對(duì)照組明顯減少，見(jiàn)圖1～4。α-SMA在正常對(duì)照組僅少量表達(dá)于血管壁平滑肌細(xì)胞（中央靜脈及匯管區(qū)的小葉間動(dòng)脈、小葉間靜脈的血管壁）；模型對(duì)照組α-SMA表達(dá)除分布于血管壁外，主要表達(dá)于肝竇內(nèi)活化的HSC、匯管區(qū)和纖維間隔內(nèi)，且陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多；利莫那班組α-SMA也主要表達(dá)肝竇內(nèi)活化的肝星狀細(xì)胞、匯管區(qū)和纖維間隔內(nèi)，但陽(yáng)性細(xì)胞較模型對(duì)照組明顯減少，見(jiàn)圖5、6。

Figure 1 The positive expression of CB1 in normal control group（SP,×100）圖1 正常對(duì)照組肝細(xì)胞CB1陽(yáng)性表達(dá)（SP,×100）

Figure 2 The positive expression of CB1 in portal area of model control group（SP,×100）圖2 模型對(duì)照組匯管區(qū)內(nèi)外CB1陽(yáng)性表達(dá)（SP,×100）

Figure 3 The positive expression of CB1 in model rimonabant group（SP,×100）圖3 利莫那班組CB1陽(yáng)性表達(dá)（SP,×100）

Figure 4 The positive expression of CB1 in endothelial cells of model control group（SP,×400）圖4 模型對(duì)照組肝竇及內(nèi)皮細(xì)胞CB1陽(yáng)性表達(dá)（SP,×400）

Figure 5 The positive expression of α-SMA in portal area of、model control group（SP,×100）圖5 模型對(duì)照組匯管區(qū)α-SMA陽(yáng)性表達(dá)（SP,×100）

Figure 6 The positive expression of α-SMA in portal area of model rimonabant group（SP,×100）圖6 利莫那班組匯管區(qū)α-SMA陽(yáng)性表達(dá)（SP,×100）

2.3 各組肝組織CB1、α-SMA和纖維化評(píng)分（S評(píng)分）比較 見(jiàn)表1。模型對(duì)照組、利莫那班組肝組織CB1評(píng)分、α-SMA評(píng)分及S評(píng)分均高于正常對(duì)照組（均P＜0.05），利莫那班組肝組織CB1評(píng)分、α-SMA評(píng)分及S評(píng)分均低于模型對(duì)照組(均P＜0.05)。

Table 1 Comparison of CB1,α-SMA and S scores between three groups表1 各組肝組織CB1、α-SMA和S評(píng)分結(jié)果比較（±s）

Table 1 Comparison of CB1,α-SMA and S scores between three groups表1 各組肝組織CB1、α-SMA和S評(píng)分結(jié)果比較（±s）

＊P＜0.05,＊＊P＜0.01，表2同；a與正常對(duì)照組比較，b與模型對(duì)照組比較，P＜0.05

正常對(duì)照組模型對(duì)照組利莫那班組F 0.60±0.36 3.57±0.68a 1.49±0.54ab 97.267＊＊10 99 0.89±0.50 5.18±1.29a 3.74±1.51ab 26.314＊＊0.92±0.47 5.32±1.31a 3.60±1.53ab 31.821＊＊

2.4 各組肝組織CB1、α-SMA及S評(píng)分之間的相關(guān)性 各組小鼠肝組織CB1評(píng)分、α-SMA評(píng)分及S評(píng)分之間均呈正相關(guān)（均P＜0.05），見(jiàn)表2。

Table 2 The correlation of CB1,α-SMA and S scores between three groups表2 各組肝組織CB1、α-SMA和S評(píng)分之間的相關(guān)性(r)

3 討論

內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)是由大麻素及其相應(yīng)受體構(gòu)成的一個(gè)生理系統(tǒng)，目前認(rèn)為內(nèi)源性大麻素具有廣泛的生物學(xué)作用，其作用發(fā)揮主要通過(guò)兩種受體即CB1和CB2而實(shí)現(xiàn)[6]。研究表明，CB1的激活可促進(jìn)肝纖維化的形成，利莫那班是第一個(gè)CB1特異性阻斷劑，可有效減輕肝纖維化的發(fā)生[7]。本研究顯示，正常對(duì)照組、模型對(duì)照組及利莫那班組CB1表達(dá)水平變化與S評(píng)分均呈正相關(guān)，證明肝組織CB1表達(dá)水平變化與肝纖維化進(jìn)展程度相一致，因此CB1有促進(jìn)肝臟纖維化產(chǎn)生的作用；同時(shí)，與模型對(duì)照組相比，利莫那班組肝組織CB1表達(dá)量明顯降低，提示利莫那班可抑制纖維組織增生，從而起到抗肝纖維化的作用。研究認(rèn)為內(nèi)源性大麻素產(chǎn)生導(dǎo)致靶向性HSC的活化增殖是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)[7]，活化的HSC是肝纖維化發(fā)生過(guò)程中產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)、促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展的主要細(xì)胞，而α-SMA是HSC活化的特異性標(biāo)志物，其表達(dá)水平的強(qiáng)弱程度與肝纖維化密切相關(guān)，已得到公認(rèn)[8]。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組α-SMA陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞輕微，而模型對(duì)照組及利莫那班組α-SMA主要表達(dá)于HSC、匯管區(qū)和纖維間隔等纖維化發(fā)生的前沿部位，但利莫那班組α-SMA陽(yáng)性表達(dá)量較模型對(duì)照組顯著減少，進(jìn)一步證實(shí)α-SMA表達(dá)與肝纖維化發(fā)生發(fā)展具有密切聯(lián)系，而經(jīng)利莫那班干預(yù)后的小鼠肝組織α-SMA則表達(dá)均明顯減弱。Julien等[9]研究證明，利莫那班導(dǎo)致的肝纖維化程度減輕與肌成纖維母細(xì)胞(即活化的HSC）凋亡增加和增殖的降低有關(guān)，對(duì)于CB1基因敲除的小鼠，利莫那班可以抑制肌成纖維樣母細(xì)胞的增殖。筆者前期通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)方法研究利莫那班對(duì)HSC-T6細(xì)胞和原代HSC增殖的影響，發(fā)現(xiàn)利莫那班可通過(guò)抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）和局部黏著斑激酶（FAK）蛋白磷酸化以及下調(diào)CB1 mRNA水平，抑制HSC的增殖和ECM的表達(dá)，并且可以促進(jìn)HSC的凋亡[10]。

總之，大麻素受體系統(tǒng)在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，CB1的激活可促進(jìn)肝纖維化的形成。利莫那班作為CB1的阻斷劑，通過(guò)抑制CB1表達(dá)，進(jìn)而抑制HSC的增殖和激活，并可促進(jìn)HSC凋亡，最終抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。通過(guò)對(duì)大麻素受體及其拮抗劑的深入研究,將有助于開(kāi)發(fā)以此為靶點(diǎn)的新型抗肝纖維化藥物。

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