任 杰 單立新 李韶深 陳 凱 侯麗英 李會(huì)強(qiáng)△

食物過敏已成為當(dāng)今社會(huì)常見衛(wèi)生問題之一，流行病學(xué)研究資料顯示，成年人食物過敏性疾病患病率為1%～2%[1]。食物過敏性疾病主要通過病史、體內(nèi)皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)和體外血清特異性IgE（specific IgE，sIgE）檢測(cè)等方法來診斷。檢測(cè)血清sIgE是確定過敏原的重要方法之一，已被臨床廣泛采用[2]。檢測(cè)血清sIgE是基于抗原-抗體特異性結(jié)合的原理[3]，即用食物提取蛋白溶液作為已知抗原包被在固相材料表面，以實(shí)現(xiàn)對(duì)未知抗體的檢測(cè)。食物蛋白組分復(fù)雜，只有獲取有效過敏原成分，才能提升血清sIgE檢測(cè)結(jié)果的靈敏度。中華對(duì)蝦是一種常見過敏性食物，研究表明原肌球蛋白雖然是蝦肉中一種重要過敏原[4]，但并不是唯一、特有的過敏原[5]。因此，若使用蝦蛋白總提取物作為包被抗原，必定會(huì)影響檢測(cè)敏感度；若使用單一組分作為包被抗原，很有可能因?yàn)檫^敏原的地域性差異而導(dǎo)致檢驗(yàn)結(jié)果的假陰性。本課題組前期研究結(jié)果表明：與血清sIgE相結(jié)合的蝦蛋白組分主要集中在分子質(zhì)量大于70 ku的蛋白，并且有些條帶反應(yīng)較強(qiáng)[6]。本研究通過分離出蝦中的大蛋白組分，并以此作為血清sIgE檢測(cè)的包被（已知）抗原，觀察能否有效提高蝦類sIgE檢測(cè)結(jié)果的敏感性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 垂直板型電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、電轉(zhuǎn)印槽（美國(guó)BIO-RAD公司）；紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo sci?entific公司）；EXL-800型酶標(biāo)分析儀（Biotek公司）。

1.1.2 主要試劑 丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸、過硫酸銨、十二烷基磺酸鈉（SDS）、四甲基乙二胺(TEMED)、吐溫-20（Tween-20）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)SM0671(MBI Fermentas公司)；聚偏二氟乙烯（PVDF）購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；馬抗人IgE-HRP抗體(美國(guó)Southern Biotech公司)；兔抗人IgE-AP抗體(美國(guó)Jackson Immunoresearch公司)；96孔酶標(biāo)反應(yīng)板(美國(guó)Costar公司)。

1.1.3 陽性患者血清和陰性對(duì)照血清 血清標(biāo)本均來自天津市北辰醫(yī)院。蝦過敏患者血清共14例，均采用德國(guó)Medi?wiss公司生產(chǎn)的Allergy Screen過敏原檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)sIgE的含量。且患者皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)均出現(xiàn)了不同程度的陽性反應(yīng)。陰性對(duì)照血清5例：來自健康體檢者，無過敏家族史、無食物過敏史、血清總IgE水平在正常范圍（20～200 IU/mL）。血清均保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 酶聯(lián)免疫印跡法分析與血清sIgE結(jié)合的蝦蛋白組分 （1）提取蝦蛋白溶液（命名為Native），經(jīng)SDS-PAGE技術(shù)分析蛋白組分。樣品蛋白濃度為14 g/L，蛋白樣品與上樣緩沖液1∶2混合，煮沸5 min，上樣20 μg；分離膠12%，堆積膠5%。以65 V電壓堆積樣本，135 V電壓分離樣品1 h。（2）蛋白轉(zhuǎn)印。采用濕轉(zhuǎn)方式，250 mA恒流，濕轉(zhuǎn)60 min，將蛋白條帶濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，后經(jīng)5%脫脂牛奶4℃封閉過夜，風(fēng)干后備用。（3）免疫印跡。將14例陽性和1例陰性血清1∶10稀釋后，分別和PVDF膜孵育3 h；TBST洗膜5次后加入1∶250稀釋的兔抗人IgE-AP抗體，室溫孵育1 h；TBST洗膜5次；加入AP顯色底物避光顯色15 min；將膜取出用蒸餾水洗凈，吹干后觀察顯色條帶。

1.2.2 葡聚糖凝膠層析法分離蝦有效致敏蛋白 采用Se?phrose 6B葡聚糖填充材料填充XK-50層析柱，用0.01 mol/L pH 7.4 PBS緩沖液平衡柱子，先將蝦蛋白溶液經(jīng)0.22 μm孔徑大小的濾膜濾除雜質(zhì)后上樣。以1 mL/min的流速洗脫蛋白，每管收集量為1 mL，核酸/蛋白檢測(cè)儀器檢測(cè)280 nm處光吸收，后經(jīng)SDS-PAGE觀察層析效果。

1.2.3 兩種已知抗原溶液用于sIgE檢測(cè)的比較 分別采用酶斑點(diǎn)印跡法和間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（間接ELISA法）對(duì)兩種已知抗原進(jìn)行評(píng)價(jià)，蝦蛋白溶液經(jīng)Sephrose 6B葡聚糖分離獲得的第一個(gè)收集峰命名為peak1-6B，以下均以此命名。（1）酶斑點(diǎn)印跡法。將剪裁好的NC膜在TBS中浸泡10 min，取出用濾紙吸干，備用。將Native和peak1-6B分調(diào)至5 g/L（0.01 mol/L TBST），分別取2 μL點(diǎn)樣于NC膜上，自然風(fēng)干。將膜浸泡于5%的脫脂奶，37℃封閉30 min。0.01 mol/L TBST洗膜3次。將2 μL1∶5(TBST)稀釋的5例不同sIgE效價(jià)（0.47、3.2、8.6、19、34 kU/L）蝦過敏患者血清和1例陰性對(duì)照血清作為一抗，分別點(diǎn)樣于包被好抗原的NC膜上，37℃反應(yīng)1 h。TBST洗3遍后，加入2 μL 250倍稀釋的兔抗人IgE-AP抗體，37℃溫育30 min。洗膜后加入AP底物顯色，觀察結(jié)果。（2）間接ELISA法。將Native和peak1-6B分別調(diào)整至50 mg/L（稀釋液0.1 mol/L pH7.4 PBS），每孔150 μL，37℃孵育2 h，4℃過夜，包被96孔微孔板。次日用洗液（0.01 mol/L pH7.4 TBST）洗滌5次。每孔加250 μL，2%PVA37℃溫育2 h，4℃過夜封閉，次日洗滌5次。分別加入1∶10稀釋（0.1 mol/L pH7.4PBS+2%Base）的陽性血清和陰性對(duì)照血清，37℃溫育1 h。洗板后加入1∶300稀釋的馬抗人IgE-HRP抗體，37℃溫育30 min后洗板。加入底物，避光顯色15 min，最終使用Biotek EXL-800酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度值（A450）。

2 結(jié)果

2.1 Native中與蝦過敏患者血清sIgE結(jié)合的組分 Native組分的SDS-PAGE分析結(jié)果如圖1a所示，至少有15條可辨認(rèn)的蛋白顯色條帶。Native免疫印跡結(jié)果可見陰性對(duì)照血清在33 ku處有較弱的顯色條帶，推測(cè)33 ku蛋白存在正常人的非特異性反應(yīng)。14例蝦過敏患者的血清sIgE主要和Native中大于55 ku的多種蛋白發(fā)生反應(yīng)。該處的顯色條帶較多，且有些條帶的顏色較深，見圖1b。

Figure 1 Results of components of Native protein and the effective sensitization component圖1 Native中蛋白組分以及有效致敏反應(yīng)組分分析結(jié)果

2.2 Sepharose 6B分離蝦有效致敏成分結(jié)果 蛋白檢測(cè)儀器檢測(cè)280 nm處發(fā)光蛋白層析圖譜，首先被洗脫的是大分子蛋白組分（peak1-6B），見圖2a。收集該組分，進(jìn)行peak1-6B的SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，peak1-6B中的主要成分為55 ku以上的大蛋白組分，而分離前37 ku和20 ku處含量相對(duì)較高的小分子蛋白被去除，見圖2b。

Figuer 2 Results of Atlas gel chromatography and the SDS-PAGE of peak1-6B圖2 凝膠層析分離圖譜(a)與peak1-6B的SDS-PAGE結(jié)果(b)

2.3 兩種蛋白溶液作為已知抗原檢測(cè)血清sIgE結(jié)果的比較 5例陽性患者和1例陰性對(duì)照血清的斑點(diǎn)印跡結(jié)果見圖3a。Image J軟件分析不同斑點(diǎn)的灰度值的點(diǎn)圖見圖3b?；颊哐逯衧IgE含量較低時(shí)，有peak1-6B作為抗原的檢測(cè)體系有較高的敏感度。間接ELISA法結(jié)果顯示：14例蝦過敏患者中，4號(hào)患者的Native作為包被抗原的A值高于peak1-6B組，其余13例患者血清以peak1-6B作為包被抗原的A值均高于Native組，見圖4。

3 討論

現(xiàn)今過敏原檢測(cè)試劑盒的抗原成分多是從食物中提取的包含全部蛋白組分的粗制品，但并不是所有的蛋白組分都是引起患者過敏的有效致敏原，這就導(dǎo)致了診斷試驗(yàn)的假陰性結(jié)果[7]。蝦過敏原研究具有明顯的地域差異,2010年，Rahman研究小組使用質(zhì)譜分析技術(shù)證明了原肌球蛋白是黑虎蝦中的主要致敏蛋白[8]。天津食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果顯示：凡納濱對(duì)蝦的主要過敏原為99、33、19、14 ku的蛋白質(zhì)組分；刀額新對(duì)蝦的主要過敏原為33 ku和24 ku的蛋白質(zhì)組分[9]。本研究顯示大于55 ku的蝦蛋白組分是和患者血清反應(yīng)的主要致敏成分，因此，提取與蝦過敏患者血清結(jié)合較強(qiáng)，但相對(duì)含量低的蛋白組分，以此作為血清sIgE檢測(cè)的已知抗原，必然會(huì)提高方法學(xué)的敏感度。本研究以55 ku為界，采用分子篩層析技術(shù)對(duì)蝦蛋白提取液進(jìn)行初步純化，從SDS-PAGE結(jié)果可以看出，應(yīng)用Sepha?rose 6B層析后，55 ku以上的大蛋白得到了初步的分離和濃縮，雖然沒有獲得純品蛋白，但從免疫化學(xué)角度看，本研究已經(jīng)獲得與待檢sIgE結(jié)合的大部分蛋白組分，可用于已知抗原檢測(cè)血清sIgE。

Figure 3 Results of dot blot analysis of peak1-6B圖3 peak1-6B斑點(diǎn)印跡分析結(jié)果

Figure 4 Comparison of the patient sIgE detected by indirect ELISA using two different antigens圖4 兩種抗原間接ELISA法檢測(cè)患者sIgE的比較

本研究選取了IgE效價(jià)由低到高的5例患者及1例健康對(duì)照的血清，進(jìn)行斑點(diǎn)印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：當(dāng)過敏患者血清效價(jià)較低時(shí)（2、3、4號(hào)）peak1-6B組分斑點(diǎn)的灰度值明顯高于Native斑點(diǎn)的灰度值。而當(dāng)抗體效價(jià)增高時(shí)，兩種蛋白組分的灰度值差異減小。因此，筆者認(rèn)為，提取的peak1-6B組分可以在患者血清中sIgE含量較低時(shí)有效提高檢測(cè)敏感度。接下來，本研究使用間接ELISA法對(duì)14例蝦過敏患者血清進(jìn)行分析，結(jié)果4號(hào)患者的Native作為包被抗原的OD值高于peak1-6B作為檢測(cè)抗原的OD值。根據(jù)4號(hào)患者的免疫印跡結(jié)果，筆者推測(cè)，由于4號(hào)患者和蝦蛋白中小于55 ku的一些組分也有較強(qiáng)的反應(yīng)，因此使用Native包板的結(jié)果高于使用peak1-6B包板的結(jié)果，但此現(xiàn)象不具有普遍性。本研究提示，大部分蝦過敏患者血清sIgE結(jié)合的蝦蛋白組分主要集中在分子質(zhì)量較大的蛋白。蝦有效致敏成分作為檢測(cè)抗原能有效提高檢測(cè)結(jié)果的信號(hào)值，這對(duì)提高過敏原檢測(cè)的敏感度具有潛在意義。

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